[发明专利]一种产N-乙酰神经氨酸重组微生物的构建方法及应用

权利要求书

1.一种重组微生物催化生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于分别表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因slr1975*和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA；

所述N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803，核苷酸序列如GenBank登陆序列号：NC_000911.1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因来源于大肠杆菌K12(Escherichia coli)，核苷酸序列如GenBank登陆序列号：NC_000913.3所示；

所述的微生物宿主是E.coli BL21(DE3)。

2.权利要求1所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因slr1975*是经密码子优化后的DNA序列。

3.权利要求1所述的重组微生物，其特征在于单独表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因的重组微生物和单独表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的重组微生物。

4.权利要求1-3所述的重组微生物，其特征在于所述N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因采用诱导表达载体pET28a进行表达。

5.权利要求1-4所述的表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因重组菌的构建方法，具体步骤如下：

1)将经密码子优化后的slr1975*基因和pET-28a(+)载体用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将slr1975*基因插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-slr；

2)将nanA基因和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将nanA基因插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-nanA；

3)将质粒pET-28a(+)-slr和pET-28a(+)-nanA分别转化E.coli，分别得到重组微生物E.coli/pET-28a(+)-slr和E.coli/pET-28a(+)-nanA。

6.应用权利要求1所述重组微生物，N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因利用IPTG分别进行诱导表达，其特征在于诱导培养基为LB培养基，诱导表达温度为28℃，诱导表达时的细胞浓度OD₆₀₀为0.6，诱导表达时间为10h。

7.权利要求1所述的生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于所述的重组微生物催化效率与酶活力存在特定的关系，优化后的酶活力比值为3:1(N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶：N-乙酰神经氨酸醛缩酶)，所述的催化反应底物N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠的浓度分别为0.6M和1.6M，Triton X-100浓度为0.4％，反应温度30-37℃，反应时间在48-60h。