[发明专利]一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及人胰岛素类似物结晶的制备方法，特别涉及一种地特胰岛素结晶的制备方法及应用。

背景技术

随着我国经济的发展，人们生活质量水平大幅度的提高，糖尿病患者的数量也急剧增长。根据最新调查报告显示，中国糖尿病患者持续增加，至2013年，成人糖尿病患病率接近12％，糖尿病患者人数突破1亿，位居全球第一位。糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷后/或其生物效应降低(胰岛素抵抗)引起的以高血糖为特征的慢性全身代谢性病症。慢性高血糖将导致人体多组织，尤其是眼、肾、神经及心血管的长期损害，功能不全和衰竭，危害性极大。

胰岛素治疗一直被公认为是治疗糖尿病以及控制糖尿病患者血糖的重要手段。随着分子生物学技术和基因工程的发展，20世纪90年代末，人们在对胰岛素结构和成分的深入研究中发现，对肽链进行修饰有可能改变胰岛素的理化和生物学特征，从而能研制出较传统人胰岛素更适合人体生理需要的胰岛素类似物(Insulin analog)。人胰岛素类似物的出现，弥补了传统人胰岛素的局限性，满足不同糖尿病患者的治疗需求。

地特胰岛素作为新一代的长效可溶性胰岛素类似物，是第一个采用化学修饰的方法获得的胰岛素类似物，即将人胰岛素天然排列在B30位的苏氨酸去掉后，通过酰化反应，在B29位的赖氨酸ε氨基上结合一个14碳脂肪酸链(肉豆蔻酸)。一方面，这14碳脂肪酸侧链可使地特胰岛素在皮下注射后形成双六聚体而延缓吸收，同时还与皮下组织的的白蛋白可逆性结合，进一步减缓入血速度；另一方面，地特胰岛素在进入外周血循环后，98％与白蛋白可逆性结合，靶器官分布也延缓。这些特点使地特胰岛素的作用时间长达24小时。在多个国家的研究学者发布的地特胰岛素最新研究结果中显示，地特胰岛素与其他胰岛素相比，具有长效降糖作用的同时，糖尿病患者用后出现低血糖较少，且还具有独特的减少体重增加的作用。

以固态晶体形式存在的胰岛素，相比较于不定形固体粉末以及溶液状态的形式，对于产品稳定性、贮存性能等均较为有优势。因此，亟需一种有效能将地特胰岛素结晶的方法。中国专利CN201110118026.2公开了一种长效胰岛素类似物—甘精胰岛素(Gly^A21-Arg^B31-Arg^B32-人胰岛素)的结晶方法：在室温条件下，制备含2.8～3.2g/L甘精胰岛素、体积分数为10～30％的乙醇、体积分数为0.01～0.2％的苯酚、0.4～0.6M乙酸、70～100mg/L氯化锌、0.3～0.4M氯化钠的结晶液，调节pH值至8.0～8.5，将结晶液温度降至2～8℃，调节pH值至7.1～7.8，结晶3h。本发明发明人参照此专利中的实施例1和实施例2进行了地特胰岛素结晶的制备，未能得到地特胰岛素结晶。应用甘精胰岛素结晶的制备方法进行地特胰岛素结晶，地特胰岛素只能形成沉淀。根本原因在于甘精胰岛素与地特胰岛素是两种分子结构完全不同的胰岛素，物理化学性质差异大。甘精胰岛素是将人胰岛素的A21突变并添加B31和B32位氨基酸形成的，即Gly^A21-Arg^B31-Arg^B32-人胰岛素，其等电点变为6.7左右，在中性pH条件下微溶。而地特胰岛素是用脂肪酸链酰化修饰去(B30)人胰岛素得来的胰岛素类似物，即赖氨酸B29(N^ε-十四烷酰)去(B30)人胰岛素，其疏水性增强，等电点约为5.0至6.0，但在中性pH条件下澄清易溶。其次由于甘精胰岛素难溶于中性pH条件，因此结晶中使用了大量的有机酸作为溶解缓冲体系，但这反而不利于地特胰岛素结构的稳定。可见，地特胰岛素的结晶对于pH，缓冲盐，离子强度，溶液组成等与其他胰岛素相比有着完全不同的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种地特胰岛素结晶的制备方法。该方法能更好的与上游工艺衔接(可从干燥/冻干固体粉末样品或者纯化收集的液体样品中直接制备地特胰岛素结晶)；该方法获得的地特胰岛素结晶具有均一稳定的固体形态，沉降体积小，易于与上清分离(可采用离心或抽滤的方式)，冻干时间短，适合工业化生产。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种地特胰岛素结晶的制备方法，包括如下步骤：在0.1～0.2M柠檬酸三钠体系，并且含体积百分比5～10％的有机溶剂的条件下，从含有地特胰岛素、锌离子、酚类物质及一定盐浓度的结晶液中，在pH8.0～8.5的条件下使地特胰岛素结晶。

所述的地特胰岛素结晶的制备方法，优选包含如下步骤：