[发明专利]一种庆大霉素的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学发光检测试剂盒及其检测方法。特别是检测牛奶、奶粉等样品中庆大霉素残留量的磁免疫化学发光检测试剂盒。属于免疫学检测领域。

背景技术

庆大霉素(Gentamicin)是由小单胞菌发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素。广泛应于质量革兰氏阴性菌引起的感染。庆大霉素抗菌谱较广，可以有效抑制细菌的生长和繁殖，是目前中国农业、畜牧业和水产业常用的兽药之一。但是随着庆大霉素的广泛使用，一些细菌逐渐对其产生了耐药性，而且对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重，随着该药物的大量使用，其残留检测也渐渐被人们所重视。我国及欧盟对庆大霉素的残留有严格要求，在牛奶中的最大残留限量不能高于100μg/kg。

庆大霉素残留量常用的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱质谱串联法(HPLC-MS/MS)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)、免疫测定法等。由于昂贵的仪器设备和复杂繁琐的操作过程，以及对检验人员的高技能要求，使得上述仪器检测方法不适合大量样品的筛查。酶联免疫检测法和胶体金免疫层析检测法虽然属于快速筛检方法，但由于方法灵敏度较低，假阴性率和假阳性率较高，逐渐被灵敏度高、准确度高、检测时间短的化学发光免疫检测方法所替代，磁免疫化学发光免疫检测试剂配套磁免疫化学发光检测仪检测食品中庆大霉素的残留，实现检测过程的全自动化，减少人为操作误差，灵敏度可达到0.1μg/L，准确度高，检测成本低，适用于大批量样品中庆大霉素残留量的筛查。

发明内容

本发明所要解决的技术问题自在于提供一种庆大霉素检测试剂盒，采用该试剂盒进行庆大霉素的检测时具有较高的灵敏度、特异性和准确度。

本发明的另一个目的在于提供一种庆大霉素的检测方法，采用该试剂盒配合化学发光检测仪进行庆大霉素的检测时不仅具有较高的灵敏度、特异性和准确度，而且实现了全自动化检测，缩短检测时间，减少人为操作误差。

为实现上述目的，本发明提供一种庆大霉素检测试剂盒，其包含的主要试剂有：酶标抗原、酶标抗原稀释液、磁标抗体、磁标抗体稀释液、庆大霉素系列标准品溶液、化学发光底物A、B液。

所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的庆大霉素半抗原的标记物，庆大霉素半抗原是用重铬酸吡啶将庆大霉素原药中的醇羟基氧化成酮基，得到单酮基庆大霉素，然后单酮基庆大霉素与对甲酸苯肼进行缩合反应，得到带有羧基的庆大霉素半抗原产物。

所述磁标抗体是庆大霉素单克隆抗体与磁珠偶联得到。

所述磁珠表面含有-OH、-COOH或-NH₂活性基团。

所述庆大霉素单克隆抗体是由庆大霉素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

所述化学发光底物A液为含有鲁米诺和对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷的溶液。化学发光液B液为含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄和CO(NH2)2·H₂O₂的水溶液。

所述试剂盒还包括标准品溶液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。

所述试剂盒可以配套化学发光检测仪进行动物源性样品中庆大霉素残留量的检测。

本发明还提供一种利用试剂盒配套化学发光仪检测庆大霉素的方法，包括下列步骤：

1)将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪酶标抗原工作液容器中；

2)将磁标抗体与磁标抗体稀释液按照1:10～1:20的体积比进行稀释，装入化学发光检测仪磁标抗体工作液容器中；

3)化学发光检测仪自分别动吸取30μL～80μL酶标抗原、30μL～80μL样品提取液和30μL～80μL磁标抗体，依次加入到反应区，在室温下反应15min，在磁分离区分离4min，弃上清液后用洗涤液300μL～500μL对复合物沉淀清洗3～5次；

4)将分离好的复合物放入测量暗箱，加入化学发光底物A液和B液各30μL～80μL，检测发出的相对光强度(RLU)，样品中庆大霉素的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU标准曲线计算庆大霉素的残留浓度。