[发明专利]用于检测津优406号黄瓜杂交种子纯度的核苷酸序列及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的DNA序列，及其利用该序列鉴定津优406号黄瓜杂交种子纯度的方法。

背景技术

种子纯度鉴定是保证种子质量的关键环节。随着育种进程的加快 ,黄瓜新品种数量不断增加,需要进行品种纯度鉴定的材料量将会越来越大。以往常规的纯度鉴定都是在田间进行，结瓜期由专家到田间观察品种的特征特性及一致性，存在周期长、工作量大、易受环境因素的影响、表型特征会有一定程度偏差等问题,可能影响品种纯度鉴定的准确性，并直接影响到到良种的推广；此外由于鉴定周期长，当年生产的种子往往要到次年才能销售，造成商机丧失。

津优406黄瓜杂交种子是由父本和母本经过授粉获得的杂交一代种子，具有杂交品种高产，性状优良的特点，但同时存在母本自交获得的自交种子掺杂在其中的风险，以往进行品种纯度鉴定往往需要进行田间栽培的方式，观察植株以及商品瓜来确定是否为杂交一代品种，主要缺点有二：第一是周期长，一般收货籽种的时间是每年7-10月，津优406为露地品种需要春季或夏初播种鉴定，因此往往需要等到来年才能进行栽培鉴定，并且每次从栽培到商品瓜出现需要至少50天，导致新采收的籽种不能及时上市；第二鉴定标准模糊，田间鉴定的鉴定标准很主观，完全通过目测与已确定是杂交一代籽种的植株和商品瓜进行对比，标准不明确。

分子标记技术的诞生，为种子纯度的分子鉴定奠定了技术基础。分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。尤其是微卫星（SSR）技术，微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中，具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子，易检测、重复性好、省时，适合于大通量分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测津优406号黄瓜杂交种子纯度的引物序列。

  本发明的另一个目的是克服现有技术的不足，提供一种能快速地检测津优406号黄瓜杂交种子纯度的方法。本发明的检测方法具有快速、简便、稳定、可靠、低成本、不受环境条件影响等优点，在黄瓜种子纯度鉴定上具有很大的应用价值。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种用于检测津优406号黄瓜杂交种子纯度的核苷酸序列,其特征在于所述的核苷酸序列具有：SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列，其序列如下：

上游引物CTTGTTTTCTTGTGGAATGTGA

下游引物ATGGGGATTTGGAGAGGTTC。

本发明进一步公开了采用该核苷酸序列检测津优406号黄瓜杂交种子纯度的方法, ,其特征在于按如下的步骤进行:

（1）      提取津优406号黄瓜杂交种子基因组DNA；

（2）进行PCR扩增：在PCR扩增专用薄壁管中加入津优406号黄瓜杂交种子基因组DNA 10～20ng，再加入上游引物15～30ng、下游引物15～30ng、1倍的含Mg²⁺的PCR缓冲液、dNTP 2mmol、Taq DNA聚合酶 0.5～1单位，加无菌重蒸馏水至10μl;将PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94 ℃预变性180 秒；94 ℃变性30秒,50-55℃退火30 秒,72℃延伸60 秒 ，30个循环；再72℃延伸7 min，扩增完成；

（3）PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；指的是TBE电泳缓冲液成分-Tris，硼酸和EDTA,用量500mL，

每1L TBE电泳缓冲液含有12.1gTris，5.5g硼酸0.744克EDTA用去离子水溶解，比例关系为 16.3:7.4:1。

（4）依据被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，检测津优406号黄瓜杂交种子纯度。从照片上可以看到津优406号杂交种子在145bp左右同时具有箭头1和箭头2所示的条带，在此位置只有1或者2，或者二者都没有的，不是该品种。

本发明公开的用于检测津优406号黄瓜杂交种子纯度的核苷酸序列及检测方法与现有技术相比具有如下的积极效果：