[发明专利]具有强RNA干涉效果的脂质修饰的双链RNA

说明书

本申请是申请日为2008年10月24日的中国发明专利申请No.200880113141.7(PCT申请号为PCT/JP2008/069829)的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种能够有效地抑制靶基因表达的脂质修饰的双链RNA。更具体而言，本发明涉及一种具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率(uptake efficiency)并且产生优异的RNA干涉效果的脂质修饰的双链RNA。

背景技术

有效地治疗癌症和AIDS等难治疾病的药物的开发是生命科学领域中的一个重大课题。攻克上述课题的一种有效的方法是使用仅作用于特定基因的基因药物。特别是，作为这样的基因药物，利用长21个碱基的短双链RNA(小干涉RNA：siRNA)的RNA干涉(RNA interference：RNAi)法最近受到更多的关注。上述RNAi法在1998年由Fire等人首次报道(参见非专利文献1)。根据Fire等人的报道，当与欲抑制功能的基因的特定区域同源的100个碱基对左右的双链RNA被导入细胞内时，通过切酶(Dicer)的作用双链RNA分解成20～25个碱基对左右的片段，之后与多种蛋白质复合，形成RNA/蛋白质复合体(该复合体称作RISC：RNA诱导沉默复合体)，所述复合体与由靶基因产生的mRNA的同源位点结合，从而强力地抑制基因表达。但是，据报道：当将约30个碱基对或更长的长双链RNA导入哺乳动物细胞中时，作为抗病毒应答的干扰素应答被诱导，结果导致细胞凋亡的现象。因此，认为RNAi法难以适用于哺乳动物。Tuschl等人化学合成了在双链RNA的两个3’末端具有悬端(dangling end)的21个碱基长度的双链RNA，并且报道当将这种双链RNA直接导入哺乳动物细胞内时，该双链RNA能够序列特异性地强有力地抑制基因表达，同时避免干扰素应答(参见非专利文献2)。Tuschl等人进一步合成了由19个碱基对的双链区域和位于3’末端或5’末端的各种长度的悬端组成的短双链RNA，并且研究了它们的RNA干涉效果。结果观察到在两个3’末端具有2个碱基的悬端的21个碱基长度的siRNA显示出非常强的RNA干涉效果，而没有其它类型的短双链RNA显示出显著的RNA干涉效果。根据上述报道，目前通常使用下述RNA干涉法，其采用21个碱基长度、在两个3’末端具有2个碱基的悬端的双链RNA。此处为了与RNAi法相区别，将使用21个碱基长度的短双链RNA来抑制靶基因表达的方法称作“siRNA法”。

由于上述siRNA法使用合成的RNA，所以较容易制备样品，操作也简单，并且能够产生非常强的效果，因此，siRNA法不仅在生命科学领域，在生物技术商业领域也广泛受到关注。

但是，上述优异的siRNA法也存在必须要解决的问题。如上所述，siRNA由容易被核酸酶的作用分解的RNA分子组成。双链RNA区域与单链RNA相比，对培养基及/或细胞中含有的核酸酶具有相当的高抗性。但由19个碱基对组成的双链RNA几乎不产生已知的RNA干涉效果。因此，有报道称，当被导入含有靶基因序列的细胞内时，虽然合成的siRNA在大约2天～大约4天的时间里产生强基因表达抑制效果，但之后其RNA干涉效果迅速减弱，到7日左右几乎完全消失。

最近为了使合成的siRNA具有提高的细胞导入率和延长的高活性RNA干涉效果，报道了各种化学修饰的siRNA。例如为了提高对核酸外切酶消化的抗性，合成了在siRNA末端用氨基、巯基或脱碱基位点修饰的siRNA。但是，已经有报道称，大多数末端修饰的21个碱基长度的siRNA具有显著减弱的RNA干涉效果。

近年来，J.Rossi等人报道了27个碱基对的双链RNA比21个碱基长度的双链RNA产生高100倍左右的RNA干涉效果(参见非专利文献3)。推断这是由于27个碱基对的RNA被RNase III样酶切酶切割成21个碱基长度的siRNA后，蛋白质复合体RISC识别siRNA，使得可以高效地产生siRNA效果。

如上所述，由于27个碱基长度的RNA可以产生优异的RNA干涉效果，所以更期待使用这种RNA作为基因药物。但是，完全不清楚何种技术方法对增强27个碱基长度的RNA的RNA干涉效果有效。此外，也不清楚何种技术方法可提高具有RNA干涉效果的长于或短于27个碱基的双链RNA的RNA干涉效果。