[发明专利]一种荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Cy7的荧光探针及其在检测半胱氨酸(Cys)中的应用。

背景技术

L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸。含巯基的半胱氨酸(Cysteine,Cys)与高半胱氨酸(Homocysteine,Hey)是同时表达在真核细胞内的含巯基的氨基酸，分子结构只有一个亚甲基的区别，功能差异则非常明显。Cys作为人体必须的氨基酸之一，是参与蛋白质合成的20中氨基酸中的一种，同时也是构建重要的谷胱甘肽的三个氨基酸之一，而Hey为甲硫氨酸代谢的中间产物，本身不参与蛋白质的合成，体内高半胱氨酸含量的大小与许多疾病相关联。现代医学研究表明，细胞内Hey的高表达与心血管疾病及阿尔茨海默与进行性老年痴呆有直接关联。因此，研制高选择性地识别半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光探针具有十分重要的意义。

正是因为半胱氨酸具有如此重要的生理和病理学意义，对存在于生物系统中的半胱氨酸检测引起了人们的广泛重视。荧光探针是有效检测生命体内半胱氨酸的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。近年来，能够应用于检测活细胞中半胱氨酸的荧光探针如雨后春笋般涌现了。在可见光区更长区段(对生物组织伤害更小)的检测半胱氨酸的荧光探针仍具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于选择性检测半胱氨酸的荧光探针。

本发明采用的技术方案如下：一种荧光探针，所述的荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示：

上述的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)中间体1的合成：在N₂保护下，将Cy7荧光染料、无水乙腈和甲胺水溶液混合后，于常温下反应，TLC跟踪反应终点，将反应物过硅胶柱(200-300目的硅胶柱)，干燥，得中间体1；中间体1的结构如(II)所示：

优选的，Cy7荧光染料与甲氨的摩尔比为1:1-1.5；

TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇＝2-4:1。

2)中间体2的合成：在N₂保护下，于冰水浴中，将硫代乙酸和2-碘乙醇混合，缓慢滴加1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)，滴加完成后，将混合液置于室温下反应，TLC追踪反应终点，反应物过硅胶柱，得中间体2；中间体2的结构如(Ⅲ)所示：

优选的，硫代乙酸、DBU和2-碘乙醇的摩尔比为1-1.5:1-1.5:1；

TLC跟踪反应终点的展开剂为二氯甲烷。

3)中间体3的合成：在N₂保护下，于冰水浴中，将中间体1、无水二氯甲烷和三乙胺混合，缓慢滴加三光气【双(三氯甲基)碳酸酯】的甲苯溶液，滴加完成后，将混合液置于室温下搅拌反应，TLC追踪反应终点，至反应液由蓝色变为绿色，将反应液在真空状态下旋干，无水乙醚洗涤，收集滤饼，得中间体3；中间体3的结构如(Ⅳ)所示：

优选的，中间体1、三乙胺与三光气的摩尔比为1:15-25:5-7；

TLC跟踪反应终点的展开剂为，按体积比，乙酸乙酯：甲醇＝10:1。

4)荧光探针的合成：在N₂保护下，将中间体2、中间体3和三乙胺混合，于30-40℃下反应，TLC追踪反应终点，得到目标产物荧光探针；其结构式如(I)所示。

优选的，三乙胺、中间体2和中间体3的摩尔比为1-1.5:2-2.5:1-1.5。TLC跟踪反应终点的展开剂为乙酸乙酯：甲醇＝10：1。

本发明的荧光探针，采用Cy7作为荧光母体，在Cy7母体上引入硫酯类结构，使得探针能够测定半胱氨酸，与半胱氨酸发生反应，指示半胱氨酸的存在或定量测定半胱氨酸的浓度。

本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定性检测。应用于定性检测半胱氨酸时，其是与半胱氨酸作用后，从而导致荧光改变；此过程可用于定性检测半胱氨酸。

本发明的荧光探针，可对半胱氨酸定量检测。将浓度呈梯度变化的半胱氨酸的PB缓冲液分别加入荧光探针的PB缓冲液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧光强度，然后以半胱氨酸的浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧光强度从图中读出待测溶液中半胱氨酸的含量。此过程可用于定量检测半胱氨酸。