[发明专利]一种来自水稻的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种来自水稻(Oryza sativa)的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1的分离和克隆及应用。

背景技术

转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。全球转基因作物的研发和应用正步入快车道。由于转基因作物的基因来源超越了本物种的范围，打破了原有物种生殖隔离的界限，转基因技术的潜在安全风险也引起广泛关注。

筛选标记基因的潜在安全风险是目前公众对转基因技术担忧的一个重要方面。现有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记。抗生素标记基因与插入的目的基因一起转入目标作物中，用于帮助在植物遗传转化筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。标记基因本身并无安全性问题。但该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。

为避免对抗生素等传统筛选剂的依赖，降低抗生素抗性基因等筛选标记的潜在风险，近年来一些安全性更好的筛选标记基因应用于转基因作物的研发，并取得了很好的效果。如磷酸甘露糖异构酶(phosphate mannose isomerase，PMI)基因是一种糖代谢基因，水稻等许多高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏磷酸甘露糖异构酶，或者表达量很低，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用。因此磷酸甘露糖异构酶可以作为筛选标记基因。而且与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达磷酸甘露糖异构酶，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率较高。甘露糖广泛存在于海藻、蕨类等植物中，同时PMI的催化产物6-磷酸果糖是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。因此PMI基因是一种安全筛选标记，有效避免了抗生素、除草剂等抗性基因存在的潜在风险。目前，PMI筛选标记基因已在水稻、小麦、玉米、马铃薯等作物中得到成功应用，在开发安全性较好的转基因作物及其产品方面，具有广泛的应用前景。

但现在广泛使用的磷酸甘露糖异构酶是从原核生物大肠杆菌中分离而来的，这是因为目前人们还没有意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧，或者是人们对这种从原核生物大肠杆菌中分离出的PMI的安全性没有引起足够的重视。因此，本领域有对安全性更好的高等植物源PMI筛选标记基因的迫切需求，但目前还没有高等植物源的PMI筛选标记基因的报道。

发明内容

本申请的发明人基于在转基因领域多年的研究经验，意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。针对目前来自大肠杆菌的PMI筛选标记所可能带来的安全隐患，以及高度植物源PMI筛选标记基因研究较少的现状，本发明希望获得高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，并以其为安全的筛选标记基因进行植物遗传转化。

为了实现本发明的目的，发明人针对可能含有磷酸甘露糖异构酶基因的不同植物，进行了大量植物提取实验和酶活分析，并最终从水稻中成功分离、克隆了磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1，并以其作为筛选标记基因，成功获得了转基因植物。

更具体而言，本申请的发明人从水稻(Oryza sativa)中分离、克隆了磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI1。另外，本发明还构建了含有OsPMI1的原核表达载体，应用于OsPMI1蛋白的酶活分析；构建了含有OsPMI1的植物表达载体，并以其作为筛选标记，应用于植物遗传转化。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，该磷酸甘露糖异构酶基因提取自水稻，本发明将其命名为OsPMI1。

优选地，该磷酸甘露糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1为：