[发明专利]通过荧光共振能量转移方法原位定量活细胞中的蛋白质‑蛋白质相互作用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及蛋白质相互作用的方法，更具体地，涉及通过荧光共振能量转移方法确定细胞中第一蛋白与第二蛋白是否存在相互作用的方法。

背景技术

共振能量转移(RET:resonance energy transfer)，1948年由科学家Forster首次发现，因此称为FRET(Forster resonance energy transfer)。同时由于受体通常为荧光分子，由此FRET也常被诠释为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer)。荧光蛋白FRET在研究活体(活细胞)水平上的分子间相互作用具有高度的特异性和灵敏性，使其成为生命科学领域重要的研究手段和方法。

然而，目前常用的FRET方法尚存在各种缺陷，例如，受体光漂白FRET(apFRET)是一种自身对照的FRET测量方法，该方面是目前比较准确的FRET效率定量技术。但它的不足在于其对细胞有很大的光毒性，只能做一次而且时间分辨率很差(通常需要好几分钟)；pcFRET是把光切换荧光基团和apFRET相结合的技术，运用这种方法，供体的荧光强度随着受体的光切换而振荡，它保留了apFRET效率计算的准确性特点，同时，相较于apFRET，它大大缩减了成像时间(～10秒)，使计算具有可重复性，减少了对细胞的光毒性，减弱了对荧光蛋白的淬灭，但pcFRET不适合作为双杂交FRET的定量工具。

因此，FRET技术仍有待于进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能在FRET定量、无需计算所需的对照实验、能观察动力学过程、对样品具有普适性四个方面满足要求的新型FRET方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

发明人发现，将荧光蛋白Dronpa标记的ICDIF与荧光蛋白rsTagRFP标记的PreIQ3-IQD-AD共表达于哺乳动物HEK293T，采用dsFRET的方法，即通过在下列三种条件的每一种条件下：(a)打开荧光蛋白Dronpa，打开荧光蛋白rsTagRFP；(b)打开荧光蛋白Dronpa，关闭荧光蛋白rsTagRFP；以及(c)关闭荧光蛋白Dronpa，打开荧光蛋白rsTagRFP，分别用下列三种激发光和发射光的条件下检测所述细胞的荧光值：(1)用504nm的光照射样品，同时用542nm的发射滤波片去接收发射光；(2)用504nm的光照射样品，同时用620nm的发射滤波片去接收发射光；(3)用565nm的光照射样品，同时用620nm的发射滤波片去接收发射光。通过对获得的荧光值进行拟合计算，获得FR值，通过FR值进一步判断蛋白质之间的相互作用。发明人发现采用本发明的双光切换FRET法(dual-switchable FRET，dsFRET)比现在广泛使用的3-cube FRET方法，计算更加准确、稳定，对不同状态的细胞更具普适性，更能体现出真实的蛋白之间相互作用情况。

因而，本发明提供了一种通过荧光共振能量转移方法确定细胞中第一蛋白与第二蛋白是否存在相互作用的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)在细胞中表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白包括第一蛋白和作为供体的第一可关闭荧光蛋白，所述第二融合蛋白包括第二蛋白和作为受体的第二可关闭荧光蛋白；