[发明专利]通过荧光共振能量转移方法原位定量活细胞中的蛋白质‑蛋白质相互作用

权利要求书

1.一种通过荧光共振能量转移方法确定细胞中第一蛋白与第二蛋白是否存在相互作用的方法，其特征在于，包括：

(1)在细胞中表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，其中，所述第一融合蛋白包括第一蛋白和作为供体的第一可关闭荧光蛋白，所述第二融合蛋白包括第二蛋白和作为受体的第二可关闭荧光蛋白；

(2)在下列三种条件的每一种条件下：

(a)打开所述第一可关闭荧光蛋白，打开所述第二可关闭荧光蛋白；

(b)打开所述第一可关闭荧光蛋白，关闭所述第二可关闭荧光蛋白；以及

(c)关闭所述第一可关闭荧光蛋白，打开所述第二可关闭荧光蛋白，

分别在下列三种激发光和发射光的条件下进行检测所述细胞的荧光值：

(i)激发光的波长为n1，发射光的波长为n2，其中，n1表示所述第一可关闭荧光蛋白的激发波长，n2表示所述第一可关闭荧光蛋白的接受波长；

(ii)激发光的波长为n1，发射光的波长为n4，其中，n4表示所述第二可关闭荧光蛋白的接受波长；以及

(iii)激发光的波长为n3，发射光的波长为n4，其中，n3表示所述第二可关闭荧光蛋白的激发波长，

以便获得由下列荧光绝对值组成的数据集：S_{n1_n4}(D&A)、S_{n1_n2}(D&A)、S_{n3_n4}(D&A)、S_{n1_n4}(D_Only)、S_{n1_n2}(D_Only)、S_{n3_n4}(D_Only)、S_{n1_n4}(A_Only)S_{n1_n2}(A_Only)和S_{n3_n4}(A_Only)，

其中，(D&A)表示所述第一可关闭荧光蛋白和第二可关闭荧光蛋白均被打开，

(D_Only)表示所述第一可关闭荧光蛋白被打开，所述第二可关闭荧光蛋白被关闭，

(A_Only)表示所述第一可关闭荧光蛋白被关闭，所述第二可关闭荧光蛋白被打开；以及

(3)基于所述数据集，确定参数FR数值，并且基于所述参数FR数值确定所述第一蛋白与所述第二蛋白之间是否存在相互作用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一可关闭荧光蛋白选自下列：

Dronpa、PDM1-4、Dronpa-2、Dronpa-3、reFastLime、bsDronpa、Padron、Mut2Q和reEGFP之一。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一可关闭荧光蛋白为Dronpa。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二可关闭荧光蛋白选自下列：

RFP、asFP595、KFP1、rsCherry、rsCherryRev和rsTagRFP之一。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二可关闭荧光蛋白为RFP。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RFP为rsTagRFP。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Dronpa具有SEQ ID NO：1所示的序列。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述rsTagRFP具有SEQ ID NO：2所示的序列。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，n1为500nm，n2为540nm，n3为565nm，n4为620nm。

10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述参数FR数值是基于下列公式确定的：

其中，

n1表示所述第一可关闭荧光蛋白的激发波长；

n2表示所述第一可关闭荧光蛋白的接受波长；

n3表示所述第二可关闭荧光蛋白的激发波长；以及

n4表示所述第二可关闭荧光蛋白的接受波长。