[发明专利]耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及传染病检测技术领域，是一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法。

背景技术

登革病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)，为单股正链RNA病毒，是人类最重要的虫媒病毒，能够引起登革热和登革出血热，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。该病广泛流行于热带和亚热带地区，是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病。近些年，全球气候变暖，人口流动等因素导致在亚洲、非洲和南美洲的热带以及亚热带地区登革病毒感染的发病率呈明显上升趋势，在我国南部地区也常有小范围的爆发流行。因此，能及时地检测和准确快速地诊断是控制疾病发展的首要步骤，核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为登革病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。

登革病毒依抗原性不同可分为1、2、3、4四个血清型，基因组RNA约含有11000个核苷酸，基因组只有一个开放读码框，编码三个结构蛋白(C、PrM和E)和七个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)，基因组的5′端和3′端均有一段高度保守的非编码区，是登革病毒通用核酸检测的主要靶基因。

目前，国内外针对登革病毒建立了多种核酸检测方法，其中应用最多是RT-PCR和荧光RT-PCR方法，市场上也有多种不同厂家生产的核酸检测试剂盒，这些试剂盒在检测特异性、灵敏度等方面均有不同，直接影响检测结果的一致性和准确性。此外，目前登革病毒通用核酸检测方法和试剂使用的质控样品多选择质粒DNA，不能实现核酸提取过程的有效监控，难以保证检测结果的准确性。因此，研制一种既稳定又没有传染性可用于登革病毒通用核酸检测的质控样品对于其检测方法和试剂的标准化、规范化使用及临床检测具有重要意义。

目前装甲RNA质控品多通过聚二乙醇沉淀或者氯化铯超速离心进行纯化，纯化方法繁琐，纯化效果一般，因此建立简便，高效的纯化方法也是制备和推广装甲RNA质控品的关键因素。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法，操作简单，效果好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法，包括以下步骤：

(1)、采用一步法RT-PCR，以MS2RNA为模板扩增外壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因片段，回收片段和D-pET32a均用BamH I和Hind III双酶切后连接，转化DH-5α菌株，获得假病毒表达载体D-pET32a-CP；

(2)、用Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒通过PCR扩增的方法在D-pET32a-CP载体的衣壳蛋白基因第16个密码子后插入编码6个组氨酸的DNA序列，成功得到带有组氨酸标签的假病毒表达载体D-pET32a-CP-His；

(3)、登革病毒3’URT基因克隆于原核表达载体D-pET32a-CP-His中，获得表达载体D-pET32a-CP-His-DFV；

(4)、将表达载体D-pET32a-CP-His-DFV转入表达菌株中，诱导表达，离心，收集沉淀，镍柱亲和层析纯化获得病毒样颗粒。

优选的，登革病毒3’URT基因通过RT-PCR扩增获得。

优选的，步骤(4)具体操作为：将D-pET32a-CP-His-DFV质粒转化表达菌株BL21(DE3)，阳性克隆接入3mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；1∶100接种过夜培养液至100mL含LB液体培养基中，37℃振荡培养3h左右至OD值0.6-0.8；在培养物中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，28℃继续振荡培养16h后取出，12000rpm收集菌体；用QIAgen Ni-NTA Fast Start Kit纯化获得内含登革病毒3’URT基因装甲RNA病毒样颗粒。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：利用MS2噬菌体装甲技术和定点突变技术，制备了带有组氨酸标签和登革病毒3’URT基因的装甲RNA质控品，通过镍柱亲和层析纯化得到登革病毒装甲RNA质控品，该质控品具有易于纯化，稳定，高浓度，无生物传染性，耐RNase等特点，可对登革病毒检测中的病毒提取，逆转录，PCR等全过程进行质量控制。