[发明专利]耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法

权利要求书

1.一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法，包括以下步骤：

(1)、采用一步法RT-PCR，以MS2 RNA为模板扩增外壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因片段，回收片段和D-pET32a均用BamH I和Hind III双酶切后连接，转化DH-5α菌株，获得假病毒表达载体D-pET32a-CP；

(2)、用Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒通过PCR扩增的方法在D-pET32a-CP载体的衣壳蛋白基因第16个密码子后插入编码6个组氨酸的DNA序列，成功得到带有组氨酸标签的假病毒表达载体D-pET32a-CP-His；

(3)、登革病毒3’URT基因克隆于原核表达载体D-pET32a-CP-His中，获得表达载体D-pET32a-CP-His-DFV；

(4)、将表达载体D-pET32a-CP-His-DFV转入表达菌株中，诱导表达，离心，收集沉淀，镍柱亲和层析纯化获得病毒样颗粒。

2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于：登革病毒3’URT基因通过RT-PCR扩增获得。

3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤(4)具体操作为：将D-pET32a-CP-His-DFV质粒转化表达菌株BL21(DE3)，阳性克隆接入3mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；1∶100接种过夜培养液至100mL含LB液体培养基中，37℃振荡培养3h左右至OD值0.6-0.8；在培养物中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，28℃继续振荡培养16h后取出，12000rpm收集菌体；用QIAgen Ni-NTA Fast Start Kit纯化获得内含登革病毒3’URT基因装甲RNA病毒样颗粒。