[发明专利]激酶活性测定方法、ATP衍生物及其用途及制造方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及测定样品中的激酶的活性的方法、ATP衍生物、含ATP衍生物的试剂盒及制造ATP衍生物的方法。

【背景技术】

作为激酶活性的测定方法，例如，有人提议作为磷酸基供体代替使用腺苷三磷酸(以下也称为“ATP”)而使用腺苷5’-O-(3-硫代三磷酸)(以下也称为“ATPγS”)的细胞周期蛋白依赖性激酶的活性的测定方法(参照美国专利公开No.2002/0164673)。

US专利公开No.2002/0164673中记载的方法如下进行。首先，在细胞周期蛋白依赖性激酶/细胞周期蛋白复合物的存在下，使底物蛋白质和ATPγS反应，向所述底物蛋白质的丝氨酸残基或苏氨酸残基导入ATPγS来源的单硫代磷酸基。接下来，使标记荧光物质或标记酶结合于导入的单硫代磷酸基的硫原子，得到标记的底物蛋白质。其后，由所述标记的底物蛋白质的标记荧光物质来源的荧光量或标记酶的反应发生的生成物的量算出细胞周期蛋白依赖性激酶的活性值。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

但是，期望可以更高灵敏度测定激酶活性的方法。

本发明的目的是，鉴于上述以往技术的实际情况，提供以更高灵敏度测定激酶活性的方法、ATP衍生物、含其的试剂盒、及ATP衍生物制造方法。

【解决课题的技术方案】

本发明提供激酶活性的测定方法。此方法包括以下的工序。

(A)使含激酶的被检样品、上述激酶的底物和含二硝基苯基(DNP)的腺苷三磷酸(ATP)衍生物反应，得到含向上述底物导入DNP基的含有DNP基的底物的混合物的工序，

(B)将上述工序(A)中得到的混合物和与上述DNP基结合的抗体混合，使含有上述含DNP基的底物和上述抗体的复合物形成的工序，及

(C)通过检测上述复合物来测定上述激酶的活性的工序。

在此方法中，ATP衍生物是DNP基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的化合物。

本发明提供腺苷三磷酸(ATP)衍生物，其为二硝基苯基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的ATP衍生物。

本发明提供制造二硝基苯基经接头结合于腺苷三磷酸(ATP)的γ位的磷酸基的ATP衍生物的方法。此方法包括以下的工序：

使式(II)：

DNP-R²   (II)

(式中，R²表示氨基酸残基，DNP表示二硝基苯基。)所表示的化合物、

具有可与R²连结的第1反应基及可与X²连结的第2反应基的二官能性接头、和

式(III)：

(式中，X²表示反应基(但是，除含DNP的官能团之外))所表示的化合物反应的工序。

【发明效果】

由本发明可以更高灵敏度测定激酶活性。

【附图说明】

【图1】是显示本实施方式中涉及的激酶活性的测定方法的原理的概略说明图。

【图2】(A)显示实施例1中使用的ATPγS的吸光光谱、(B)显示实施例1中使用的DNP-Lys的吸光光谱、(C)显示实施例1中得到的反应生成物的吸光光谱。

【图3】是显示实施例1的结果的图。

【图4】是显示实施例1的结果的图。

【图5】是显示评价实施例2及比较例1各自的测定方法的结果的图。

【实施方式】

接下来参照附图描述本发明的优选的实施方式。

【ATP衍生物】

本实施方式中涉及的ATP衍生物以DNP基经接头与ATP的γ位的磷酸基结合作为特征。本实施方式中涉及的ATP衍生物由ATP部分和DNP基部分构成。