[发明专利]16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于细菌基因检测技术领域，特别涉及氨基糖苷类抗生素耐药基因16s rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

16S rRNA甲基化酶是2003年报道的一种新耐药决定因子，介导细菌对多种氨基糖苷类高水平耐药，最初发现于肠杆菌科中，目前在革兰氏阴性菌中已发现至少由12种等位基因编码的10种16S rRNA甲基化酶。该类耐药决定因子的作用机制独特，能够以S-腺苷甲硫氨酸分子为甲基供体，对核糖体RNA进行转录后甲基化，使氨基糖苷类不能与其作用靶点相接合，从而导致多种革兰氏阴性杆菌同时对阿米卡星、庆大霉素等多种临床常用氨基糖苷类药物高度耐药。目前已从多个国家和地区及多种临床革兰氏阴性杆菌中检测到编码RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、RmtE、RmtF、RmtG、RmtH、ArmA及NpmA等16S rRNA甲基化酶的耐药基因及其等位基因。由于大多编码16S rRNA甲基化酶的基因常位于可移动的遗传因子如接合型质粒、整合子、转座子、插入序列共同区上，易引起耐药性和耐药基因的传播，因而导致临床抗感染治疗的失败。

RmtB广泛存在于黏质沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等临床菌中，且在来源于日本、中国台湾、韩国、墨西哥、希腊、中国、比利时、埃及、美国、巴西等国家和地区的多种菌株中均有相关报道。

对于携带氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB，它的实验室诊断主要基于PCR技术进行确证。PCR方法容易产生假阳性，并且检测成本高，操作比较复杂，检测时间长(一般需要2-3小时)，这些都影响了临床携带rmtB基因的检测结果。

环介导等温扩增方法(LAMP)是近几年新兴的一种基因扩增方法，对仪器设备要求不高，只需要恒温水浴锅或金属浴即可，成本低，且临床上容易做到，检测时间较短(不超过1个小时)，为快速、准确诊断基因的一种新方法。环介导等温扩增方法已经广泛应用于检测细菌领域，并有很多相关专利获得授权。目前国内外均未见使用LAMP方法检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB基因的报道。

发明内容

为了解决PCR扩增易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，填补使用LAMP检测氨基糖苷类抗生素耐药基因16S rRNA甲基化酶rmtB的空白，本发明提供了16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法。

本发明是通过以下措施实现的：一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物，由一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成，其核苷酸序列分别如下：

外引物F3：5’-CGATGCCCTCACCTCCAT-3’(SEQ No.1)；

外引物B3：5’-GCCTTTTTTACATCGCCCG-3’(SEQ No.2)；

内引物FIP：5’-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3’(SEQ No.3)；

内引物BIP：5’-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3’(SEQ No.4)；

环引物L：5’-GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3’(SEQ No.5)。

其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物(F3或B3)与环引物的摩尔比为1:4。

本发明还公开了一种含有上述检测引物的LAMP检测试剂盒。

优选的，上述LAMP检测试剂盒，包括若干个(至少3个)装有反应液的LAMP反应管，其中，每25μL反应液中含有：12.5μL 2×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物L、待检细菌基因组DNA若干(一般为1-2μL)，余量为灭菌双蒸水；

其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；

2×等温反应缓冲液中含有40mM pH为8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO₄、20mM(NH₄)₂SO₄、0.2wt％Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。