[发明专利]16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物，其特征是，由一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个环引物L组成，其核苷酸序列分别如下：

外引物F3：5’-CGATGCCCTCACCTCCAT-3’；

外引物B3：5’-GCCTTTTTTACATCGCCCG-3’；

内引物FIP：5’-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3’；

内引物BIP：5’-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3’；

环引物L：5’-GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3’。

2.一种含有权利要求1所述引物的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。

4.如权利要求2所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，它包括若干个装有反应液的LAMP反应管，其中，每25μL反应液中含有：12.5μL 2×等温反应缓冲液、1.0μL Bst DNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物L、待检细菌基因组DNA若干，余量为灭菌双蒸水。

5.如权利要求4所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述2×等温反应缓冲液中含有40mM pH为8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO₄、20mM(NH₄)₂SO₄、0.2wt％Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。

6.如权利要求5所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL。

7.如权利要求5或6所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测试剂盒，其特征是，所述25μL反应液中还含有1μL的钙黄绿素。

8.一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是，

(1)提取待检细菌基因组的DNA；

(2)使用权利要求6所述的LAMP检测试剂盒进行检测：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应45-60min；

(3)结果判断：反应结束后，凭借肉眼可见的白色沉淀判定结果，有白色沉淀为阳性，清亮为阴性；

所述方法用于非诊断和治疗目的。

9.一种16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是，

(1)提取待检细菌基因组的DNA；

(2)使用权利要求7所述的LAMP检测试剂盒进行检测：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有rmtB基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应45-60min；

(3)结果判断：反应结束后，凭借反应液的颜色判定结果，绿色的为阳性，仍保持橙色的为阴性；

所述方法用于非诊断和治疗目的。

10.如权利要求8或9所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测方法，其特征是，所述步骤(1)提取待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过夜培养后，取1mL的菌液12000rpm离心2min，彻底弃上清，取沉淀加入1mL无菌双蒸水，沸水浴10min，12000rpm离心2min，取上清至新离心管中，测定并调整DNA浓度为300-500ng/μL，-20℃保存备用。