[发明专利]Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法。

背景技术

大面积骨缺损一直是创伤骨科的治疗难题。目前，传统的自体骨、异体骨以及人工骨材料的填充都难以有效治疗大面积的骨缺损。而骨组织工程通过整合支架材料、种子细胞、活性因子等提高人工骨材料的成骨活性，对促进骨愈合有重要作用。

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一类具备多方向分化潜能的非造血干细胞，在一定的诱导条件下能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化，促进骨愈合。而且骨髓间充质干细胞在临床上已被应用于治疗移植物抗宿主病和同种异体造血干细胞移植，其生物安全性已得到证实。然而骨髓间充质干细胞不易于外源基因导入，因此选择合适的基因转染技术至关重要。

Runx2在成骨分化的信号途径中起核心作用，能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化并成熟，从而促进骨愈合。

把目的基因转移到靶细胞中的方法有很多，目前应用的基因载体分为两大类:非病毒载体和病毒载体。非病毒载体主要包括脂质体、聚合物等，这类载体的优点是可以大量生产，毒性反应及免疫抑制方面也相对较安全，但其转染效率低、表达量低、体内应用较困难。病毒载体主要有3种：反转录病毒、慢病毒和腺病毒。目前，还没有使用Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，旨在提供一种利用携带Runx2基因的慢病毒感染骨髓充质干细胞、构建感染骨髓间充质干细胞珠、表达成骨基因的问题。

本发明是这样实现的，一种Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，包括下述步骤：

Runx2基因提取及质粒构建：从骨肉瘤细胞系中抽提总RNA，反转录成cDNA，分别设计Runx2基因的下游引物和下游引物，利用上述引物通过反转录PCR扩增Runx2基因；将慢病毒表达载体质粒与所述扩增Runx2基因使用PspXI限制性内切酶进行酶切处理，将酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物质粒抽提，得到Runx2重组慢病毒载体质粒；

Runx2重组慢病毒的包装：将所述Runx2重组慢病毒载体质粒和包装质粒共转染至293Ta细胞中，进行病毒包装，获得Runx2重组慢病毒，并对病毒滴度进行监控；

Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质干细胞，加入Runx2重组慢病毒进行慢病毒感染，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。

本发明提供的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，操作简单，从骨肉瘤细胞获取Runx2基因片段，然后利用慢病毒载体将Runx2导入至骨髓间充质干细胞基因组DNA中，无明显的毒性反应，细胞生长良好。获得的感染骨髓间充质干细胞能够很好地表达Runx2基因-Runx2基因在骨髓间充质干细胞中表达水平增高，同时可提高成骨因子的表达水平。

附图说明

图1是本发明实施例提供的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法流程示意图；

图2是本发明实施例提供的反转录PCR扩增产物电泳结果图；

图3是本发明实施例提供的Runx2重组慢病毒载体质粒酶切鉴定电泳结果图；

图4是本发明实施例提供的Runx2重组慢病毒的包装步骤中，不同慢病毒液体积感染H1299细胞的绿色荧光图；

图5是本发明实施例提供的原代骨髓间充质干细胞形态学观察结果图；

图6是本发明实施例提供的第3代骨髓间充质干细胞形态学观察结果图；

图7是本发明实施例提供的流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞鉴定结果图；

图8是本发明实施例提供的Runx2重组慢病毒感染细胞骨髓间充质干细胞形态学观察结果图；

图9是本发明实施例提供的RT-qPCR分析目的基因感染骨髓间充质干细胞后在1，4，7，14d成骨相关基因的表达结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。