[发明专利]Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法

权利要求书

1.一种Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，包括下述步骤：

Runx2基因提取及质粒构建：从骨肉瘤细胞系中抽提总RNA，反转录成cDNA，分别设计Runx2基因的上游引物和下游引物，利用上述引物通过反转录PCR扩增Runx2基因；将慢病毒表达载体质粒与所述扩增Runx2基因使用PspXI限制性内切酶进行酶切处理，将酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物质粒抽提，得到Runx2重组慢病毒载体质粒；

Runx2重组慢病毒的包装：将所述Runx2重组慢病毒载体质粒和包装质粒共转染至293Ta细胞中，进行病毒包装，获得Runx2重组慢病毒，并对病毒滴度进行监控；

Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质干细胞，加入Runx2重组慢病毒进行慢病毒感染，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，其特征在于，在所述Runx2基因提取及质粒构建的步骤中，所述上游引物序列为：5’-actagatgctttattggatccggtaccatggcatcaaacagcctcttcag-3’；所述下游引物序列为：5’-agctgggttgcggccgcactcgagctaatatggtcgccaaacagattcat-3’。

3.如权利要求1所述的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，其特征在于，在获得感染骨髓间充质干细胞后，还包括检测骨髓间充质干细胞中Runx2基因、骨形态发生蛋白的表达水平。

4.如权利要求3所述的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，其特征在于，在获得感染骨髓间充质干细胞后，还包括检测骨髓间充质干细胞中骨钙蛋白、碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨粘连蛋白基因的表达水平。

5.如权利要求1-3任一所述的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞提取方法为：取4周龄SD大鼠，用体积浓度10％水合氯醛麻醉后，颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出胫骨；使用含质量浓度10％的胎牛血清、质量浓度1％双抗的DMEM高糖培养基缓慢冲洗获得骨髓细胞并移至培养皿；培养24小时后使用PBS液洗去悬浮细胞，48小时后再次使用PBS液冲洗悬浮细胞；待细胞长满培养皿底后0.25％胰酶消化；用上述方法传代2次，获得第3代骨髓间充质干细胞。

6.如权利要求1-3任一所述的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，其特征在于，在所述Runx2基因提取及质粒构建的步骤中，将慢病毒表达载体质粒与所述扩增Runx2基因使用PspXI限制性内切酶进行酶切处理后，将酶切处理产物通过in-fusion反应，连接Runx2基因和慢病毒表达载体质粒。

7.如权利要求1所述的Runx2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法，其特征在于，在所述Runx2重组慢病毒的包装步骤中，采用荧光法对所述Runx2重组慢病毒的病毒滴度进行监控，具体方法为：将所述Runx2重组慢病毒感染H1299细胞，荧光镜下每个96孔板样品随机抽取10个视野范围，输出荧光细胞数，根据公式计算：病毒液滴度＝平均荧光数×细胞总数/实际添加的病毒液体积，获取病毒滴度。