[发明专利]基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术

链霉素( streptomycin, SM) 是一种常见的氨基葡萄糖型抗生素, 是由土壤放线菌产生的，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有显著的抗菌效果, 能够有效抑制细菌的生长和繁殖(如：结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性细菌引起的其他传染病)。可有效防治植物细菌病害，例如：梨火疫病、蓝莓菌、烟草野火病等，因此目前常用于畜牧业和水产业中。然而链霉素在畜牧业中的滥用造成农产品中的药物残留引发一些疾病。因此，检测食品中的链霉素的残留量已变得非常重要。

检测链霉素的方法主要有链霉素的检测方法主要包括微生物法、免疫分析法、色谱法和其他方法。

目前，主要用来检测链霉素的方法包括微生物法和高效液相色谱法（HPLC）。然而这两种方法均存在自身不可避免的缺陷。微生物分析法的稳定性差，灵敏度低，菌不易筛选；而HPLC需要较为昂贵的样品预处理。因此，目前需要建立一种高灵敏度，高效，特异性检测链霉素的方法来检测食品中残留的链霉素。

发明内容

为了解决现有技术中检测链霉素的方法的缺陷，本发明提供一种高特异性和灵敏性、成本低、高效快速的基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器。同时，本发明还提供了基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了3条DNA链：

①一发卡结构HAP，其作用是特异性识别并捕获链霉素

②一条ssDNA辅助单链

③一条修饰在金电极表面的MB capture probe，能与ssDNA完全互补

三条DNA链序列：

Aptamer即HAP：

3’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTGCAGGCGGATCCAGACCCCAAACACAA-5’（ SEQ ID NO：1）；

ssDNA: 3’-GTCTGGATCCGCCTGC-5’（ SEQ ID NO：2）；

MBcapture probe: 3’SH-GCAGGCGGATCCAGAC-MB 5’（ SEQ ID NO：3）。

发卡结构HAP 3’端（HAP序列中的加粗部分）可以与链霉素特异性识别并紧密结合，发卡构象发生变化。

辅助链ssDNA可以与发卡部分碱基（HAP序列中有下划线部分）互补配对。

修饰有亚甲基蓝（MB）捕获探针（MBcapture probe）的碱基序列与ssDNA完全互补。其3’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将捕获探针固定在电极表面。其5’端修饰有亚甲基蓝（MB），它可以一定的电位下发生氧化还原反应，我们就是通过检测MB氧化还原信号差值来达到定量的检测目标物的目的。

本发明中用到了一种酶：限制性核酸外切酶ExoⅢ。ExoⅢ能且只能剪切DNA双链，可以将与HAP杂交的ssDNA剪切掉，得以循环，实现信号放大。

本发明中链霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过一步循环的方式来实现信号的放大，从而实现链霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：发夹结构的DNA中有目标物的适配体，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹结构链打开。此时均相中的ssDNA就可以与打开的发夹结构发生互补配对，从而将ssDNA与HAP 固定到一起。此时在Exo Ⅲ核酸外切酶的作用下，将杂交的双链上ssDNA水解。使打开的HAP可以与其他ssDNA杂交，实现HAP的循环利用及信号的循环放大。由于单链的MB capture probe是一种柔性结构，5’ 端的MB离电极表面很近，可以产生较大的电信号。当MB capture probe与ssDNA杂交后，形成的杂交双链是一种刚性结构，致使5’ 端的MB远离电极表面，阻碍了MB与电极之间的电子传递，产生的电信号降低。本发明就是根据反应前后的电信号差来实现目标物的定量检测。

在均相反应中，放大的反应条件为37℃，反应时间是2h。

一种基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器，在金电极上依次修饰有MB capture probe层、HAP与ssDNA层；