[发明专利]一种高效CIK细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体地说是一种通过添加IL-1、IL-2、IFN-γ、CD3 AK 、EGF作为诱导因子，有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量、所培育CIK细胞可大幅增加子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率的高效CIK细胞培养方法。

背景技术

随着细胞生物学技术、临床医疗技术的研究深入和发展，进一步推动了细胞培养技术迅速发展，然而对自体免疫细胞的培养研究有限，从而限制了免疫细胞治疗各类疾病的技术发展和应用。

细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，CIK）是一种新型的免疫活性细胞，CIK 细胞增殖能力及细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。作为一种新型的、高效的、非 MHC 限制性的免疫活性细胞得到了广泛应用。CIK细胞的实质和来源是指CD3+、CD56+的淋巴细胞，存在于正常人体中，但含量较少，约占5%以下｡目前国内外用于临床的CIK细胞制品，就是在体外倍增出的以这些细胞为主的细胞群｡

随着生物医学技术的发展，CIK 细胞已在临床大量应用，疗效也得到一定程度的认可，为进一步提高 CIK 细胞的增殖能力及细胞杀伤能力，人们正逐渐寻求和改进 CIK 细胞的体外培养和处理办法。有研究者在培养基中加入植物血凝素，刺激 T 细胞增殖。为了使体内 CD3+、CD56+及 CD8+细胞等明显增多，有学者用重组的 MVC-1 病毒疫苗刺激淋巴细胞获得无人白细胞抗原限制性的杀伤性 T 淋巴细胞。还有研究者应用基因工程技术对 CIK 细胞的修饰，即转基因 CIK 细胞，在 CIK 细胞上转染含有 IL-2、I L-7、IL-24、共刺激分子如 B7 分子家族、细胞黏附分子和 LFA23 等基因，可以使 CIK 细胞在体内不断增殖，使血清中某些细胞因子水平增高，而提高效应细胞的作用。

现在很多研究人员和机构采用的CIK培养方法效率较低，从70-100ml新鲜血液中提取的外周血单个核细胞细胞，诱导培养约14天后细胞数量仅达到10⁹数量级。

发明内容

本发明旨在提供一种高效的CIK细胞体外培养的方法，具体地说是一种通过添加IL-1、IL-2、IFN-γ、CD3 AK 、EGF作为诱导因子，有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量、所培育CIK细胞可大幅增加子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率的高效CIK细胞培养方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效CIK细胞培养方法，其特征在于培养步骤为：

第一步：单核细胞分离

将定量血样装到离心管中，对血样进行离心，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐水稀释，可缓慢加入到装有血样容积20%-30%的淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离心管中，向离心管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70%-80%，将白细胞稀释液进行离心处理，吸弃上清；用血样容积5%-10%的生理盐水重悬，加入血样容积70%-80%的生理盐水离心后，弃去上清后，得到细胞沉淀；

第二步：接种培养瓶

取血样容积5%-10%的TCM-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25%-35%的TCM-199培养基，混匀后置于T175培养瓶中；用血样容积30%-60%的TCM-199培养基清洗离心管，清洗后，将洗涤液倒入T175培养瓶中；向T175培养瓶中分别加入HEPES-TL 、IL-2、IL-24、IFN-γ后，将培养瓶放入培养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加IL-1、CD3 AK、EGF；第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75%-80%的TCM-199培养基；第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的TCM-199培养基；

第三步：接种培养袋

在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用TCM-199培养基洗涤培养瓶后，将洗涤液倒入培养袋，向培养袋中加入TCM-199培养基至终容积为血样容积15-18倍，同时添加EGF和IL-24，用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋放入培养箱中培养；

第四步：收取细胞

在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70%-75%的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内的细胞并放入生物安全柜中，用碘伏对剪刀以及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋出液管，将细胞培养液经离心后，弃去上清，获得CIK细胞。