[发明专利]一种高效CIK细胞培养方法

权利要求书

1.一种高效CIK细胞培养方法，其特征在于培养步骤为：

第一步：单核细胞分离将定量血样装到离心管中，对血样进行离心，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐水稀释，生理盐水稀释血细胞时，稀释比例为1:1，缓慢加入到装有血样容积20％-30％的淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离心管中，向离心管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70％-80％，将白细胞稀释液进行离心处理，吸弃上清；用血样容积5％-10％的生理盐水重悬，加入血样容积70％-80％的生理盐水离心后，弃去上清后，得到细胞沉淀；

第二步：接种培养瓶取血样容积5％-10％的TCM-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25％-35％的TCM-199培养基，混匀后置于T175培养瓶中；用血样容积30％-60％的TCM-199培养基清洗离心管，清洗后，将洗涤液倒入T175培养瓶中；向T175培养瓶中分别加入HEPES-TL、IL-2、IL-24、IFN-γ后，将培养瓶放入CO₂培养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加IL-1、CD3AK、EGF；第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75％-80％的TCM-199培养基，胎牛血清为血样容积的5％-10％；第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的TCM-199培养基,其中，HEPES-TL、IL-2、IL-24、IFN-γ、IL-1、CD3AK、EGF浓度范围均在9-11ng/ml；

第三步：接种培养袋在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用TCM-199培养基洗涤培养瓶后，将洗涤液倒入培养袋，向培养袋中加入TCM-199培养基至终容积为血样容积15-18倍，同时添加浓度范围均在9-11ng/ml的EGF和IL-24，用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋放入CO₂培养箱中培养，CO₂培养箱的培养环境均为37℃、7.5％CO₂；

第四步：收取细胞在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70％-75％的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内的细胞并放入生物安全柜中，用碘伏对剪刀以及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋出液管，将细胞培养液经离心后，弃去上清，获得CIK细胞。

2.根据权利要求1所述的一种高效CIK细胞体养方法，其特征在于将培养瓶内细胞倒入培养袋时，可将注射器套筒插入进液管作为漏斗。