[发明专利]一种细菌内毒素核酸适体及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种核酸，特别涉及细菌内毒素的核酸适体及其在去除细菌内毒素中的应用。

(二)背景技术

1892～1895年，Richard Pfeiffer发现，热灭活的霍乱弧菌溶解物中，含有一种毒性成分，能引起实验动物休克和死亡。为了与霍乱弧菌所分泌的不耐热外毒素相区分，他将该热稳定的物质称为内毒素。

内毒素主要成分是脂多糖(LPS)，其化学结构主要分为两部分：多糖和类脂A(Lipid A)，其中类脂A是内毒素的活性中心。在已经知道的各种热源性物质中，内毒素是普遍存在也是最重要的一种。它是革兰氏阴性杆菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖类物质，极微量(纳克级)内毒素进入人体就会引起高热，腹泄，血管扩张，浑身不适，甚至昏厥或死亡。常规的内毒素去除方法有：活性炭吸附、萃取、超滤、多粘菌素B等。常规方法由于特异性不强，或者其本身存在毒性，不利于内毒素安全、特异性的去除。因此设计一种高亲和力和高选择性的结合细菌内毒素配基将会对内毒素的控制和去除有重要意义。

核酸适体是指从人工合成的单链DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G－四聚体等，从而特异地识别靶物质并影响其生物活性。核酸适体本身特有的生化特性使其在生物医药应用领域具有诸多优势，如靶分子范围广、亲和力与特异性强、合成修饰方便快速、良好的生物相容性、其组成为无毒的核苷酸、体外稳定性好等。核酸适体可以通过配体指数富集进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选获得，其基本原理是在体外人工化学合成一个寡核苷酸文库，包括RNA、ssDNA或修饰的RNA和ssDNA，通过寡核苷酸文库与目标分子的相互作用，结合PCR技术指数级放大与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或数十轮筛选过程，获得高亲和力和高特异性的核酸适体。

由于常规内毒素去除方法特异性不强，或者其本身存在毒性，不利于内毒素安全、特异性的去除，而核酸适体由于其本身特有的生化特性有利于内毒素高效，特异性的去除。将带上生物素的核酸适体与带有链霉亲和素的磁珠结合后即得核酸适体－磁珠，该带有核酸适体的磁珠可用于样品中内毒素的去除，且将磁珠放于磁力架上就可将内毒素与溶液分离，该去除内毒素的方法简单、快速、特异性好。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种具有高特异性和高亲和力的细菌内毒素的核酸适体，以及该核酸适体在去除细菌内毒素中的应用，将核酸适体与带有链霉亲和素的磁珠结合后即得核酸适体－磁珠，该带有核酸适体的磁珠可用于样品中内毒素的去除，且将磁珠放于磁力架上就可将内毒素与溶液分离，该去除内毒素的方法简单、快速、特异性好。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种细菌内毒素核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1(记为EAQ1)、SEQ ID NO.2(记为EAQ2)或SEQ ID NO.3所示(记为EAQ3)，优选SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1：

ATGAGAGCGTCGGTGTGGTACCACGCGCGGACAACAAGACAGCGTGCCTGCAGTGTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA；

SEQ ID NO.2：

ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATCGCCGCGCTCGCCGATCGTTCCTCCCCCCCCGTGTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA；

SEQ ID NO.3：

ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGCCATGCGCCGACCCAGGTCTAAGAGCCTCGGCCGTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA。

本发明所述细菌内毒素核酸适体的制备方法包括以下步骤：