[发明专利]一种细菌内毒素核酸适体及其应用

权利要求书

1.一种细菌内毒素核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

2.一种权利要求1所述细菌内毒素核酸适体的制备方法，其特征在于所述方法为：（1）合成两端为固定序列、中间为35个碱基的随机序列的单链DNA随机寡核苷酸库，将合成的单链DNA随机寡核苷酸库溶于结合缓冲液1形成0.05～0.15µM核酸溶液，将核酸溶液在90℃加热5min，在冰上放置15min，然后室温放置5min，获得预处理后的单链DNA随机寡核苷酸库；所述结合缓冲液1组成为20mmol/L HePes，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCl，lmmol/L MgCl₂，l mmol/L CaCl₂，pH7.3；

所述单链DNA随机寡核苷酸库的序列为：

5'-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-35nt-TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3'，nt表示35个碱基的随机序列；

（2）以键合多粘菌素B的琼脂糖凝胶颗粒为基质，加入内毒素孵育后，再加入预处理后的DNA随机寡核苷酸库孵育，除去上清液，用洗脱缓冲液洗涤，收集流出液，获得与细菌内毒素特异结合的单链DNA；所述洗脱缓冲液组成为20mM Tris-HCL，4M异硫氰酸胍，1mM DTT，pH8.3；

（3）将步骤（2）所得与细菌内毒素特异结合的单链DNA在引物1和引物2的作用下进行对称PCR扩增反应，再将对称PCR扩增产物在引物2和引物3的作用下进行不对称PCR反应，获得的单链DNA经切胶、纯化，即得用于此轮筛选的单链DNA文库，形成次一级核酸库；

引物1：5'-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3'；

引物2：5'-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3'；

引物3：5'-biotin-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3'；

（4）将步骤（3）所得的单链DNA文库，按步骤（2）和步骤（3）进行下一轮筛选，经过10～20轮筛选后获得目的寡核苷酸序列，即为细菌内毒素核酸适体。

3.一种权利要求1所述细菌内毒素核酸适体在去除内毒素中的应用，其特征在于所述应用是将细菌内毒素核酸适体与磁珠结合，然后再与待测样本中的内毒素特异性结合，从而去除待测样本中的内毒素。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：将细菌内毒素核酸适体与带链霉亲和素的磁珠在缓冲液中于20～40℃孵育25～70min，得到核酸适体-磁珠，再将此核酸适体-磁珠与待测样品在缓冲液中于20～40℃孵育25～35min，取上清液，获得去除内毒素的样本。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为：将链霉亲和素磁珠加入离心管中，将离心管放置在磁铁上1～2min，吸去上清；取下离心管用结合缓冲液2洗涤；将细菌内毒素核酸适体与结合缓冲液2的混合液加入离心管中，室温静置30min；将离心管放于磁铁上1～2min，吸去上清，用结合缓冲液1洗涤；向离心管中加入待测样本的结合缓冲液1溶液，37℃孵育30min；将离心管放于磁铁上1～2min，吸取上清，即可得到去除内毒素的样本溶液；所述结合缓冲液2组成为1mM EDTA 、2M NaCl 、10 mM Tris-HCl，pH 7.5，结合缓冲液1组成为5mmol/L KCl、120mmol/L NaCl、lmmol/L MgCl₂、l mmol/L CaCl₂、20mmol/L HePes、pH7.3。

6.如权利要求3-5之一所述的应用，其特征在于链霉亲和素磁珠为Dynabeads M-280 Streptavidin。