[发明专利]一种检测核酸分子缺失突变的方法

权利要求书

1.一种检测核酸分子是否存在缺失突变的方法，其包括以下1)～4)项：

1)根据核酸分子缺失的断裂点位置，设计荧光探针，使荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间具有不同的熔点(Tm)值；

2)设计扩增核酸的引物组，该引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在缺失突变的核酸分子，且扩增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域；

3)以待检核酸样本为模板，利用步骤1)和2)设计的探针和引物组，进行PCR扩增和熔解曲线分析；

4)根据熔解曲线分析中是否有相应的熔解峰和/或熔点(Tm)值的大小来判定是否存在核酸缺失突变，以及任选地判断缺失突变的类型。

2.权利要求1的方法，其中所述核酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

3.权利要求1的方法，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，例如是指100nt以上的寡核苷酸片段的缺失。

4.权利要求1的方法，其中所述荧光探针选自自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针(如HyBeacon探针)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

5.权利要求1的方法，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点(Tm)值相差2℃以上。

6.权利要求1的方法，其中所述荧光探针为一种或多种。

7.权利要求1的方法，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量(上游引物过量或下游引物过量)。

8.权利要求7的方法，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为(2～100):1，例如为(4～50):1，例如为(5～20):1，例如为(5～10):1。

9.权利要求1的方法，其中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为100-400bp。

10.权利要求1的方法，其中所述的引物组选自以下(1)～(3)项：

(1)所述的引物组包含一种上游引物和一种下游引物；

(2)所述的引物组包含一种上游引物和两种下游引物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域；

(3)所述的引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于缺失突变区域。

11.一种检测核酸分子是否存在缺失突变的反应体系，其含有至少一种待测核酸分子、至少一种荧光探针、和至少一对引物组，其中：

所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间具有不同的熔点(Tm)值，

所述引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在缺失突变的核酸分子，且扩增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域。

12.权利要求11的反应体系，其中所述核酸为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

13.权利要求11的反应体系，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，例如是指100nt以上的寡核苷酸片段的缺失。

14.权利要求11的反应体系，其中所述荧光探针选自自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针(如HyBeacon探针)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

15.权利要求11的反应体系，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点(Tm)值相差2℃以上。

16.权利要求11的反应体系，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量(上游引物过量或下游引物过量)。

17.权利要求16的反应体系，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为(2～100):1，例如为(4～50):1，例如为(5～20):1，例如为(5～10):1。

18.权利要求11的反应体系，其中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为100-400bp。