[发明专利]一种促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法

说明书

本发明基于外源导入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2到人皮肤成纤维细胞的方法，开发了一套促进成纤维细胞各阶段分化的培养系统，有效促进向成骨细胞的转化，属细胞生物学与组织工程领域。本系统包含三套培养液，分别作用转分化过程中的三个关键阶段：a,维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增值;b,调控RUNX2在特定时间内的表达；c,细胞重编程后，提高细胞向成骨细胞的转化效率，缩短转化时间。从而实现人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向的转分化。三套培养液之间相互配合，根据细胞最后的使用目的，分别作用时间可以灵活调控，能够培养较大规模的诱导性成骨细胞。用于骨代谢性疾病，骨折等的细胞治疗。本发明的药物组合也可用于组织工程骨的研发和生产。为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。

技术领域

本发明涉及一种作用于Runx2表达的人皮肤成纤维细胞重编程为成骨细胞的诱导培养方法，特别小分子化合物和激素联合作用的,是一套培养方法促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法。属于细胞生物学与组织工程领域。

背景技术

骨组织工程技术通过将各种生物活性因子整合到或者把具备特殊结构的三维支架用于接种种子细胞,诱导各种来源不同的种子细胞向成骨方向分化,形成组织工程复合骨,以替代传统的骨骼修复材料。种子细胞按照来源不同，主要有分化晚期的成骨细胞、成骨细胞株、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞等，也包括非成骨细胞如皮肤成纤维细胞转分化而来的类成骨细胞。其中来源于皮肤成纤维细胞的类成骨细胞，来源丰富，容易从患者获取和体外大量扩增培养，得到了广泛的研究。经典的方法是通过ips的方法，先将皮肤成纤维细胞去分化为多能干细胞，再诱导干细胞向成骨细胞分化；另一种方法是，通过在皮肤成纤维细胞中高表达特定的成骨转录因子，使细胞直接转分化为成骨细胞。这两种方法虽然分化途径不同，外源倒入的基因不同，但是在分化过程中，都需要一整套性状稳定，高效诱导，便宜且容易获取的分化培养液，以支持细胞的转分化过程和满足骨组织工程所需的大量细胞培养要求。

目前已有报道的成骨细胞转分化因子如BMP-2,BMP-7，LMP3单独或协同作用可以使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞。这几种基因表达产物为分泌性的蛋白质，其表达分泌调控复杂。由于它们能通过旁分泌作用于周围的非骨质组织引起异位骨形成，在转分化细胞中长期持续高表达可能导致对移植部位周围健康组织的副作用。而且，由于重组蛋白成本高，长时间性状不稳定，因此不利于大规模的细胞分化产。

2013年邓宏魁报道，通过筛选了10000种小分子化合物后，找到4种小分子，可以实现皮肤成纤维细胞的重编程，其中CHIR99021和Forskolin在重编程过程中发挥了重要的作用。由此提示一些特定的小分子或者小分子组合可以促进细胞的重编程。

2006年，ANDRE′SJ.GARCI′A报道，通过使用对成骨细胞起决定性作用的关键转录因子，如在骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2，在单独用于转分化时没有效果，在有激素信号分子地塞米松的协同作用下可使大鼠的皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞。由此提示，在基础的细胞培养液中，加入某些激素和小分子化合物，通过刺激和维持某类骨组织细胞特异转录因子的表达，可以促进皮肤成纤维细胞向成骨细胞的分化。

发明内容

本发明目的之一,在外源转入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2后,通过特定的三套培养液，三套培养液分别作用转分化过程中的三个关键阶段：a,维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增殖;b,调控RUNX2在特定时间内的表达；c,细胞重编程后，提高细胞向成骨细胞的转化效率，缩短转化时间。从而最终实现人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向的转分化。

本发明的另一目的是，通过对上述的三套培养液的相互配合作用，可以维持和控制人皮肤成纤维细胞在转分化过程各阶段中相对停留的时间，细胞不会自发地很快到达成骨方向终末期，这样可以实现细胞的进一步扩增和用于治疗的移植对于细胞质量的控制。