[发明专利]一种促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法

权利要求书

1.一种促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：人皮肤成纤维细胞在外源转入骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2后,通过特定的三套培养液进行培养,让三套培养液分别作用转分化三个关键阶段过程：

a、第一套培养液TraA：10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+10ng/mL bFGF+10nM地塞米松，第一套培养液TraA用于维持RUNX2阳性细胞的高存活率和增殖，得到表达Runx2的阳性细胞，以获得更多的诱导性成骨细胞；

b、第二套培养液TraB:10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+9μM CHIR99021+10μM Forskolin+10nM地塞米松，第二套培养液TraB调控RUNX2在特定时间内的表达，维持稳定的RUNX2的表达和碱性磷酸酶的形成，促进人皮肤成纤维细胞向成骨前体细胞重编程；

c、第三套培养液TraC:10％胎牛血清Hyclone+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+高糖DMEM培养基+10mM β甘油磷酸+100nM地塞米松+0.2mM ascorbate-2-phosphate，第三套培养液TraC在细胞重编程后，提高细胞向成骨细胞的转化效率，缩短转化时间，提高人皮肤成纤维细胞向成骨细胞方向的转分化，20天以内能够看到诱导的细胞形成明显的矿化结节。

2.根据权利要求1所述的促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：所述三套培养液都能在4°C储存1个月。

3.根据权利要求1所述的促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：所述成骨细胞是由人皮肤成纤维细胞通过转录因子Runx2的表达直接转分化而得，所述皮肤成纤维细胞不需要传统的诱导性多能干细胞四因子c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2,因而不经过干细胞阶段，避免移植时成瘤风险。

4.根据权利要求1所述的促进人皮肤成纤维细胞向成骨细胞转分化的培养方法，其特征在于：三套培养液使用过程各自为：

分化第一阶段，第一套培养液TraA根据细胞生长状态，使用培养时间3-5天，不宜超过5天，培养液每隔一天换液；分化第二阶段，第二套培养液TraB需要连续使用至少10天，培养液每隔一天换液；

分化第三阶段，第三套培养液TraC每隔一天换液，之后进行茜素红染色鉴定；

茜素红染色鉴定

①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；

②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；

③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，放在培养箱中进行；

④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；

⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。