[发明专利]一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白的制备方法及其在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用。

技术背景

作为基因转移载体，腺病毒与其他病毒相比具有许多优点，包括容易制备高滴度的重组病毒、能转导多种分裂和静止期细胞、基因导入效率高、外源基因能有效表达和插入宿主基因组引起突变的风险小等，因此重组腺病毒在人和动物基因治疗和基因工程疫苗研究中已得到广泛应用。

重组腺病毒的广泛使用需要快速、经济、大量制备高质量的重组病毒，现有的重组腺病毒浓缩与纯化方法主要有化学沉淀法、超速离心法和层析法。其中，聚乙二醇沉淀法是经典的重组病毒浓缩方法，但需要离心大量的细胞培养液；硫酸铵沉淀法兼有浓缩和纯化重组腺病毒的作用，但通常需与其他纯化方法相结合才能达到纯化目的；氯化铯密度梯度离心法是制备高质量重组腺病毒的经典方法，但因难以规模化而不能满足临床应用需要；虽然许多层析法也可用于重组腺病毒的纯化，但这些方法最初为纯化蛋白而设计，纯化重组腺病毒的效果往往不佳。另外，上述重组腺病毒浓缩与纯化方法都有费力、费时、成本高和需要专门设备等缺点。

腺病毒以受体参与的胞吞机制进入靶细胞。参与不同血清型腺病毒感染的受体有多个，其中柯萨奇腺病毒受体(Coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR)是柯萨奇病毒B以及人腺病毒血清型2和5的高亲和力吸附受体，而目前用于人和动物基因工程疫苗的重组腺病毒多为血清2和5型。CAR是一种46kDa跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞浆内尾部三部分组成。其中，胞外区由D1和D2两个免疫球蛋白样结构域组成，两者之间为间隔序列。现有的研究资料显示，重组大肠杆菌表达的CAR-D1区即可与腺病毒结合，提示可以作为捕捉和浓缩腺病毒的诱饵蛋白。

类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide,ELP)是根据弹性蛋白相关序列合成的五肽(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸)聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈溶解状态，在高于相变温度溶液中呈凝聚状态，因此可用简单的离心或过滤法与细胞蛋白分离。已经表达的ELP融合蛋白能保持ELP的可逆相变特性，因此ELP已被用作纯化重组蛋白的标签蛋白，但ELP与腺病毒受体的融合蛋白能否保持可逆相变特性，并进一步用于重组腺病毒的浓缩与纯化，尚有待研究。

本发明将ELP的温度敏感相变特性与腺病毒受体的结合特异性相结合，将重组大肠杆菌表达的ELP与CAR-D1融合蛋白(ELP-CAR)用于重组腺病毒的浓缩与纯化。尽管这种策略是容易想到的，但在具体设计时却面临以下技术问题：天然CAR-D1序列是否适合在大肠杆菌中高水平表达、CAR-D1区与ELP融合后能否正确折叠、在什么条件下ELP-CAR融合蛋白能保持溶解状态、如何洗脱释放与ELP-CAR融合蛋白结合的腺病毒并不被灭活、结合融合蛋白的腺病毒是否能感染敏感细胞。为此，本发明在已知ELP序列能在重组大肠杆菌中有效表达基础上，将CAR-D1区序列优化成大肠杆菌偏爱密码子序列，以便两者融合蛋白能在重组大肠杆菌中高水平表达；利用CAR蛋白两个胞外区之间的间隔序列作为ELP与CAR-D1区的弹性间隔序列，以便CAR-D1区能在融合蛋白表面自由折叠和展示；在测得ELP-CAR融合蛋白相变温度基础上，在低于相变温度下进行融合蛋白表达和与腺病毒结合，以确保其可溶性；通过对腺病毒洗脱条件的系统优化，使腺病毒能从融合蛋白上有效洗脱并不被灭活。与现有的其他方法相比，用本发明的ELP-CAR融合蛋白不仅能从感染细胞中浓缩和纯化重组腺病毒，而且能从水等环境样品中浓缩人和动物腺病毒，纯化的重组腺病毒不仅可用于动物实验研究，还可作为基因工程疫苗。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种类弹性蛋白多肽(ELP)与柯萨奇腺病毒受体(CAR)融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明的类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白，由ELP、间隔区和CAR D1区组成。经病毒纯化试验证明，利用该融合蛋白能从重组腺病毒感染细胞及其培养上清中有效浓缩与纯化重组腺病毒。

本发明所述融合蛋白用下列方法制备：

(1)依次将ELP、间隔区和CAR D1区编码序列插入原核表达载体pET-30a，获得重组载体pET-ELP-CAR；

(2)用重组载体pET-ELP-CAR转化大肠杆菌，在20℃条件下进行ELP-CAR融合蛋白诱导表达；