[发明专利]土壤中植物病原菌含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中土壤中植物病原菌含量的检测方法。

背景技术

土传病害对植物危害严重。其病原微生物存在于土壤中，环境稳定、病原抗逆能力强，难以进行化学防治。如：十字花科根肿病(Clubroot)是由专性寄生的芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae Woronin.)引起的世界性土传病害。该病为害十字花科白菜、油菜、甘蓝、薹菜等多种栽培品种，致使根部肿大，生长不良，萎蔫、矮化，产量和质量受损，严重威胁十字花科作物的生产。植物土传病害发生的主要决定因子是播种前土壤中病原菌的含量，对土壤中植物病原菌的定量检测是采取合理防治措施的基础。

土壤中植物病原菌的检测有多种方法，如：种植感病植株、荧光显微镜检测、血清学检测、常规PCR检测和荧光定量PCR检测等。我国不同地区的土壤类别、有机质含量和pH值差异很大。同时，土壤中富含酚类、酯类、腐植酸、重金属离子等，影响DNA的提取和后续的PCR反应。目前，土壤样品DNA的制备多采用试剂盒方法，土壤样品的处理量为0.25g-1g，其生物学代表意义差，不适合大量土壤样品检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测土壤中植物病原菌的含量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了土壤中植物病原菌含量的检测方法。

本发明所提供的土壤中植物病原菌含量的检测方法，包括如下S1)和S2)：

S1)、用提取土壤微生物DNA的方法提取待测土壤微生物DNA，得到待测土壤微生物DNA；

S2)、以所述待测土壤微生物DNA为模板，用鉴定植物病原菌的成套试剂进行荧光定量PCR，通过PCR产物的荧光强度确定所述待测土壤中所述植物病原菌的含量；所述鉴定植物病原菌的成套试剂由鉴定所述植物病原菌的PCR引物对和探针组成；所述PCR引物对由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成；所述探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；

S1)所述提取土壤微生物DNA的方法包括如下S21)和S22)的步骤：

S21)向所述土壤中加入提取缓冲液得到细胞悬液；

S22)向所述细胞悬液中加入SDS得到细胞裂解液，所述细胞裂解液中的SDS的质量百分比浓度为4％，裂解细胞，得到裂解液；除去所述裂解液中的杂质得到所述待测土壤微生物DNA；

所述提取缓冲液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为磷酸缓冲液，所述溶质及其浓度为1M Tris-HCl、0.1M EDTA、1.5M NaCl、2％(质量百分比浓度)CTAB、2％(质量百分比浓度)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；所述磷酸缓冲液为由溶质和溶剂组成的缓冲液，所述溶剂为水，所述溶质为NaH₂PO₄和Na₂HPO₄，所述NaH₂PO₄在所述磷酸缓冲液中的浓度为6.8mM，所述Na₂HPO₄在所述磷酸缓冲液中的浓度为93.2mM(即所述磷酸缓冲液中H₂PO₄^-和HPO₄^2-的浓度之和为100mM)，所述磷酸缓冲液的pH为8.0。

上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述裂解细胞的时间可为2小时，所述裂解细胞的温度可为65℃。

上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述探针可标记有报告基团和荧光淬灭基团。所述报告基团具体可为FAM或ROX；所述荧光淬灭基团具体可为TAMARA或Eclipse。

在本发明的一个实施例中，所述探针的5’端标记有FAM，所述探针的3’端标记有TAMARA。

上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，S21)可包括下述S21a)和S21b)：

S21a)向所述土壤中加入所述提取缓冲液得到土壤悬液；

S21b)破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒得到所述细胞悬液。

上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述细胞悬液中土壤颗粒的直径在50微米以下。

上述土壤中植物病原菌含量的检测方法中，所述破碎所述土壤悬液中的土壤颗粒可用德国Retsch生产的PlanetaryBall Mill PM 400仪器处理所述土壤悬液。所述处理的时间可为5-20分钟，具体可为10分钟。