[发明专利]一种制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用

说明书

本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。其制备方法为：分别构建打靶载体；将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的GGTA1和iGb3S纯合子动物；再将GGTA1和iGb3S纯合子动物进行交配，筛选GGTA1和iGb3S同时缺失的双基因敲除纯合子动物，并建系获得基因敲除动物种群。

技术领域

本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。

背景技术

由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的超急性免疫排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。

已有研究显示异种抗原α-半乳糖基抗原(α-1,3-galactosyle，α-Gal)是动物源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。α-Gal是含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体内。α-Gal主要受α-1，3半乳糖基转移酶(α1,3-galactosyltransferase,α-1,3GT，或GGTA1)及异红细胞糖苷酯合成酶(isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3synthase,iGb3S)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗α-Gal抗体(占总血清球蛋白的1-3％)，因此当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。有研究证实人血清中的抗α-Gal抗体既与GGTA1催化的Gal抗原(糖蛋白)反应，也与iGb3S催化的Gal抗原(糖脂肪)反应。

国际上早在90年代就有通过构建GGTA1基因敲除小鼠，来研究α-Gal相关的免疫学反应，探讨不含Gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle等报告了GGTA1基因敲除小鼠模型的成功制作方法，之后开始有报告使用GGTA1基因敲除小鼠模型研究其与人所诱导抗体的相似性及其免疫学特征。Chiang TR等报告，GGTA1基因敲出小鼠免疫后诱导的抗-Gal抗体与α-Gal结合的亲和性和人的抗Gal抗体相似，是能够诱导Gal抗原阳性异种心脏补片的超急性免疫排斥反应。Chong A等报告，GGTA1基因敲除小鼠能够诱导自然的抗α-Gal IgM和IgG，并呈现周龄依存性增强；在同种异体或异种补片移植后可以观察到T-cell依存性的抗α-Gal抗体反应。这些研究提示GGTA1基因敲除小鼠模型对Gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。