[发明专利]一种制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用

权利要求书

1.一种制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建打靶载体：分别从基因组DNA中分离GGTA1和iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建GGTA1打靶载体和iGb3S打靶载体；

（2）将GGTA1打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得GGTA1的F1代杂合子；

（3）将iGB3S打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得iGB3S的F1代杂合子；

（4）将GGTA1的F1代杂合子和iGB3S的F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的GGTA1和iGb3S纯合子动物；

（5）再将GGTA1和iGB3S纯合子动物进行交配，筛选GGTA1和iGb3S同时缺失的双基因敲除纯合子动物，并建系获得基因敲除动物种群；

其中，非人哺乳动物为小鼠；

所述的GGTA1基因敲除为敲除GGTA1基因的功能性催化区第九外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID: 1所示；所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能性催化区第五外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID: 2所示；其中，GGTA1基因敲除为用NeoR-PA取代α-1,3GT基因的功能性催化区第九外显子，被替换部分的长度为第九外显子催化区全长694 bp加上5`端的246 bp，全部长度为940 bp；

GGTA1和iGB3S双基因敲除纯合子小鼠中alpha-Gal的表达量几乎完全被消除。

2.根据权利要求1所述的制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述的小鼠为C57BL小鼠。

3.根据权利要求1所述的制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述GGTA1打靶载体含有5`同源臂、耐药抗生素基因NeoR-PA和3`同源臂，用NeoR-PA分别取代第9外显子；所述iGb3S打靶载体含有5`同源臂、耐药抗生素基因NeoR-PA和3`同源臂，用NeoR-PA分别取代第5外显子。

4.根据权利要求1所述的制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，用于GGTA1打靶载体构建的耐药抗生素基因NeoR-PA 5`端和3`端的同源臂序列取自小鼠第二条染色体上GGTA1基因第9外显子的5`端和3`端，分别为4.123 kb和7.343 kb；用于iGb3S打靶载体构建的耐药抗生素基因NeoR-PA 5`端和3`端的同源臂序列取自小鼠第四条染色体上iGb3S基因第5外显子的5`端和3`端，分别为8.3kb和9.1kb。