[发明专利]用于以荧光显微术观察试样的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于以荧光显微术观察试样的方法，其中，应用如下的显微镜，该显微镜对通过照明光程的试样以激发光束来照明并且沿着光轴成像到照相机芯片上，其中，照明光程具有用于选择性进行目标区域照明的能够调整的光阑，选取一个在试样上的区域作为目标区域，并且用于选择性进行目标区域照明的能够调整的光阑以如下方式调整：试样的处在所选出的区域以外的部分并未被激发光束照明。

背景技术

在生物科学领域，显微镜起到重要作用。生物试样可以存在于各种试样载体上，例如处在载物片与盖玻片之间，在培养皿或微量滴定板中。生物试样可以还存活着或者被固定成为标本，未被着色或者已被着色。通常，对试样借助荧光显微术来研究。所添加的荧光团使得：有针对性地对一定的细胞组成部分加以着色。为了成像，着色物质被以适当波长的光加以激发，这通常通过入射光照明来实现，在入射光照明时，照明光线通过物镜聚焦到所观察的试样区域上。荧光信号(相对于激发光线发生红移)通过相同的物镜被吸收，借助二向色镜和适当的滤光器从激发光线中分离并且引导至照相机或接眼镜。未经着色的试样也可以借助荧光显微术来研究，只要所述试样包括自发荧光的组成部分作为荧光团。

荧光信号通常非常微弱，因此采用很高的激发光强度。但是，高强度又导致了光漂白现象增强。在这一概念之下，包括了不同的过程，这些过程导致：荧光团不再发光。在此，既可以涉及可逆的过程，其中，荧光团在与光相互作用之后仅在一定时间内熄灭，而也可以涉及不可逆的、毁坏荧光团的过程。通过减小激发光强度，能够降低光漂白的程度，但同时一般也由此降低了信号强度。这要么可以通过延长照相机拍摄时间来补偿，要么必须迁就更糟糕的信噪比。由此，这一途径由于荧光信号很弱而行不通。

另一降低光漂白的可行方案在于：仅在照相机拍摄时对试样加以照明。光源仅当进行照相机拍摄时接通，并且之后就立即关断。照明与拍摄的同步化能够以软件或硬件触发的方式来实现。可替换地，将快门引入照明光程中，快门挡住光程并且仅在照相机拍摄期间敞开光程。

另外，在具有能更换的照相机芯片的显微镜中，所谓的照明场光阑是已知的。对于这种显微镜的示例是卡尔蔡司的AxioScan.Z1。这种光阑用于在具有不同芯片尺寸的照相机中针对每台照相机都将照明区域与照相机芯片的伸展范围相匹配并且物场的其余部分不被照明。因为照相机芯片相对于光轴对中心，所以这种照明场光阑在其开口尺寸方面，能够围绕同样相对于光轴对中心的固定而置的开口中心调整。

与一定类型的荧光显微术相关地，US 8089691 B1介绍了一种能够调整的光阑装置，凭借这种光阑装置能够自由选出试样中被照明的区域。被照明的区域的范围和位置都得到调整。在美国文献中提到的显微镜用于FRAP(光漂白后荧光恢复)显微术，其中，试样中的目标区域应当被有针对性地光漂白。

在US 6944326 B1中介绍了一种方法，在所述方法中，在照相机图像中可以点出或者说捕捉到一个点，该点的坐标由软件来识别。接下来，当变换为其他放大率的物镜时，移动台面，使得所捕捉的点再度处在照相机图像的相同的位置上。此外，显微镜构造有在透射光光程中以马达驱动的照明场光阑。

在US 2005/0254696 A1中介绍了一种在透射光中工作的幻灯片扫描仪。在变换物镜之后，透射光照明场光阑能够在小孔的范围内调整到相应的物镜上。

在US 2002/0060842 A1中，介绍了如下的显微镜，该显微镜在透射光中具有以马达驱动的照明场光阑。该照明场光阑能够由用户在其尺寸方面加以改变。

使用照明场光阑的原因是：照相机芯片一般小于照相机芯片平面中最大所能传送的像场。这一特性也非常有意义，因为照相机芯片的其余部分完全不会用于试样拍摄。因为照相机芯片是矩形的，矩形处在像场圆之内，该像场圆通过对由光程传送的物场的成像来确定。照明场光阑同样地用于入射光光程和透射光光程。

发明内容

本发明的目的在于，提出一种用于对试样以荧光显微术观察的方法，在所述方法中避免了不希望的光漂白。

本发明以如下的用于对试样以荧光显微术观察的方法来实现所述目的，其中：

应用如下的显微镜，该显微镜对通过照明光程的试样以激发光束加以照明并且沿着光轴在像场中成像到能够更换的照相机芯片，其中，照明光程具有用于选择性地对目标区域照明的能够调整的光阑，

在像场内部，选出试样上的一区域作为目标区域，以及