[发明专利]构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型

说明书

本发明公开了构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型。在该构建过程中，关键是重组质粒pOPAI1B的构建，pOPAI1B中含有发光所需酶基因LuxCDABE，抗性筛选基因Apr和整合酶基因Int的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点attP和复制子。重组质粒pOPAI1B转入脓肿分枝杆菌中经过筛选获得抗性基因和整合酶基因均丢失的无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。本发明构建的自主发光脓肿分枝杆菌可以高通量筛选药物，通过检测细菌发光情况判定药物的杀菌或抑菌效果，可用于体外药物活性检测，不需要任何底物，可连续检测同一样品，灵敏度高，重复性强。

技术领域

本发明涉及一种通过生物技术改造获得的脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abcessus），具体地说是一种无选择标记的可自主发光的脓肿分枝杆菌。此外，本发明还首次将安普霉素抗性基因作为抗性筛选标记应用到脓肿分枝杆菌中。

背景技术

分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类。分枝杆菌属于含分枝菌酸类。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、一般不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，主要可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。

脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，M. abscessus）是一种快速生长的非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM），于1992年被命名。脓肿分枝杆菌可引起肺部、皮肤和皮下软组织感染，其他感染包括颈淋巴结炎、中耳等。它可以引起散在的和爆发性的流行，近年来已经成为医院内感染的重要病原菌，是在肺部疾病中最常被分离出来的快速生长的非结核分枝杆菌。在美国和澳大利亚、中国都分别有报道指出，在过去的十年中，由于脓肿引起的感染成上升的趋势。

脓肿分枝杆菌对抗生素的敏感性，多数资料表明仅有中度及低度的敏感药物，无高度敏感的药物。除少数脓肿分枝杆菌对一些氨基糖苷类药物如克拉霉素、阿奇霉素、丁胺卡那(MIC>2 μg/mL)及喹诺酮药物如阿米卡星MIC>2 μg/mL)等敏感外，对其他药物呈不同程度的耐药或部分菌株高度耐药。所有的脓肿分枝杆菌对抗结核药物均高度耐药：利福平MIC>512 μg/mL，异烟肼MIC>256 μg/mL。目前，脓肿分枝杆菌的致病和耐药机制尚不清楚，临床治疗只能依赖于药物敏感试验的结果选用抗生素治疗，但此菌生长缓慢，药敏试验结果需要4～5天时间才能完成；由于对多种抗生素耐药，治疗相当困难，使病程迁延，经久不愈。为寻找有效的治疗药物，本文就其耐药机制的研究进展进行综述。因此，寻找能够有效治疗脓肿分枝杆菌的药物具有重要的临床意义。

目前，对分枝杆菌噬菌体进行遗传操作，通常采用卡那霉素抗性基因或潮霉素抗性基因作为抗性筛选标记。但是，脓肿分枝杆菌对卡那霉素以及潮霉素B不敏感，所以为了方便对其进行遗传操作急需找到可用的抗性筛选标记。本次发明中涉及的抗安普霉素基因是首次作为抗性筛选标记在脓肿分枝杆菌中应用。