[发明专利]构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型

权利要求书

1.一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：该重组质粒pOPAI1B按逆时针方向依次含有启动子，发光所需酶基因LuxCDABE，抗性筛选基因Apr和整合酶基因Int的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点attP和复制子；

所述噬菌体整合酶Int为分枝杆菌噬菌体Tweety的整合酶Int，其序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的噬菌体整合位点attP为分枝杆菌噬菌体Tweety的attP位点，其序列如SEQ IDNO:4所示；

所述的抗性筛选基因为安普霉素抗性基因Apr，其序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：所述DifR的序列如SEQ ID NO:2所示，DifL的序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求1所述的一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：该重组质粒pOPAI1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

4.一种无抗性筛选标记的自主发光的脓肿分枝杆菌的制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

1)电转化法将权利要求1～3任一项所述的重组质粒pOPAI1B转入脓肿分枝杆菌中，获得自主发光脓肿分枝杆菌；

2)将获得的自主发光脓肿分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。

5.根据权利要求4所述的一种无抗性筛选标记的自主发光的脓肿分枝杆菌的制备方法，其特征在于：步骤2)的具体操作为：将步骤1)得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含安普霉素(Apr)的7H11板上，37℃培养，挑取在Apr板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Apr板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Apr抗性的克隆。