[发明专利]用于检测GPIb-凝血酶相互作用的调节因子的方法和用于进行该方法的测定试剂盒

说明书

本发明涉及用于检测GPIb‑凝血酶相互作用的调节因子的方法和用于进行该方法的测定试剂盒。本发明属于凝血诊断的领域。为此，将样品与分离的突变的GPIbα蛋白和凝血酶接触，并且确定突变的GPIbα蛋白和凝血酶之间的复合物的形成。

技术领域

本发明属于凝血诊断(coagulation diagnostics)的领域并且涉及用于检测样品中的GPIb-凝血酶相互作用的调节因子的方法。

背景技术

凝血酶(因子IIa)参与血浆血液凝固的多重性激活和抑制机制，并且因此是二期止血(secondary hemostasis)(其主要包括血纤蛋白的形成)的核心酶。较差的研究和理解的是凝血酶在一期止血(primary hemostasis)(其包括作为内皮损伤的结果的血小板的激活和血小板的附着)中的作用。已知的是凝血酶是血小板激活因子并刺激血小板的聚集。血小板表面上最重要的凝血酶受体是，第一，PAR受体(蛋白酶激活的受体)和第二，糖蛋白Ib-V-IX受体复合物。糖蛋白Ib-V-IX受体复合物包含内在膜蛋白(integral membraneprotein)糖蛋白Ib(GPIb)、内在膜蛋白糖蛋白IX(GPIX)和糖蛋白V(De Candia,E.,Mechanisms of platelet activation by thrombin:A short history.ThrombosisResearch 2012，129：250–256)。

GPIb是由具有约145kDa的表观分子质量的重链(同义词：α链或者GPIbα)和具有约22kDa的表观分子质量的轻链(同义词：β链或者GPIbβ)组成的双链分子，其通过二硫键连接至彼此(Lopez，J.A.et al.,Cloning of the a chain of human platelet glycoproteinIb：A transmembrane protein with homology to leucine-rich α2-glycoprotein.Proc.Natl.Acad.Sci USA 1987,84:5615–5619)。

GPIbα蛋白包含用于凝血酶的结合位点并且因此引起凝血酶结合至糖蛋白Ib-V-IX受体复合物。GPIbα链的片段是糖萼蛋白(glycocalicin)，其水解地切割自血小板膜中的完整的受体蛋白。糖萼蛋白在血浆中是可检测的。血浆中的游离糖萼蛋白的升高的浓度表示血小板功能的破坏(Beer,J.H.et al.,Glycocalicin:A New Assay–The Normal PlasmaLevels And Its Potential Usefulness in Selected Diseases.Blood 1994,83(3):691–702)。

由于凝血酶和血小板在动脉血栓形成(thrombose)的发展中起着主要作用并且由于用于预防性和治疗性应用的血小板聚集的抑制因子正被同时研究和使用，因此，凝血酶和血小板的相互作用的具体研究是有极大益处的。

因此期望具有这样的方法：其允许检测患者样品中血小板-凝血酶相互作用的调节因子(调节子，调节剂，modulator)即，抑制因子(抑制子，抑制剂，inhibitor)或者激活因子(激活子，活化剂，activator)。这样的方法将允许监测血小板抑制因子疗法或者甚至检测生理学破坏性因子，如，激活性或者抑制性自身抗体。

发明内容

本发明的目标是提供用于专门检测样品中的GPIb-凝血酶相互作用的调节因子的方法。

通过以下实现该目标：使样品与分离的GPIbα蛋白并且与分离的凝血酶接触并且测定GPIbα蛋白和凝血酶之间的复合物的形成，GPIbα蛋白是突变的，与人类GPIbα蛋白的野生型序列相比，包含至少氨基酸残基1–268并且具有在位置233、235、237和239中的至少一个处的替换Xaa(SEQ ID NO:1)。