[发明专利]一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于核酶的分子检测方法，特别涉及基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及基于该方法的检测试剂盒。

背景技术

环境中存在多种对人体有害的分子，快速、低成本地检测出这些有害小分子具有非常实际的意义。

双酚A（Bisphenol A，BPA），化学名为2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，主要用于合成环氧树脂，聚碳酸酯等多种高分子材料，被广泛用于生产各种塑料制品。双酚A主要通过食品包装材料、饮水杯、供水管、奶瓶以及塑料薄膜等渗入食品而进入体内，并能在生物体内富集，并且不易被降解。即使极低的浓度的双酚A也会对内分泌系统、免疫系统、生殖系统产生一系列的不良影响。传统的双酚A检测技术主要有高效液相色谱法等一些仪器分析方法，这些技术需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以用于大批量样本的实地现场快速检测。

另外，也有以抗体来检测双酚A的技术，但是抗体的制备过程麻烦，保存条件苛刻，而且需要多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。

G四聚体序列是由富含G碱基的一段单链DNA组成，在缓冲体系和hemin（氯高铁血红素）存在的情况下，可折叠成G四聚体二级结构。G四聚体具有类似HRP（辣根过氧化物酶）的催化活性，可催化氧化TMB（四甲基联苯胺）产生蓝色底物，使反应溶液肉眼可见。以G四聚体来检测双酚A具有操作简单，方便现场快速分析等优点。但是基于G四聚体的比色法检测灵敏度低，需要进一步提高灵敏度。传统的信号放大技术主要是PCR以及一系列依赖工具酶的信号扩增技术，但是酶的使用不仅增加了成本和操作步骤，而且酶的存储也比较麻烦，因此需要研发一种无需工具酶信号扩增技术来提高检测灵敏度。

核酸适体（aptamer，源于拉丁语）指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于DNA自组装和G四聚体的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列：

DNA1：将待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸序列中，靠近待测分子核酸适体的核酸序列依次记为1*、2*和3*区；

DNA2：DNA2至少与DNA1的1*区域和待测分子核酸适体的部分核酸互补配对；

DNA3：具有茎环结构，其核酸序列依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区，2、3和2*、3*互补配对形成茎结构，环为4*区，1、2、3分别和DNA1的1*、2*和3*区互补配对；

DNA4：具有茎环结构，其核酸序列依次为3、4、3*、2*和4*区，4和4*区形成茎结构，环为3*和2*区，3、4、3*、2*区分别和DNA3的3*、4*、3、2区互补配对；

DNA5：依次为5*、6*和G四聚体封闭区，5*、6*区与DNA3的5*和6*区相同；

DNA6：依次为G四聚体、6、5、和2区，6、5、和2区分别和DNA3的6*、5*和2*互补配对。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA2至少与待测分子核酸适体的8个碱基互补配对。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，1～6、1*～6*区中，每个区至少含有6个碱基。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA5的G四聚体封闭区至少与DNA6的G四聚体中的6个碱基互补配对。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，对1～6、1*～6*区核酸序列中的至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基配对原则的情况下提高核酸序列之间的亲和力。

一种双酚A的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列：

DNA1：5'-CGACATCT（3*）AACCTAGC（2*）TCACTGAC（1*）CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'（SEQ ID NO：1）；

DNA2：5'-TAAGCTGGAAGCGTCAGTGA-3'（SEQ ID NO：2）；