[发明专利]一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株能高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，本发明还涉及所述蜡样芽孢杆菌在生产L-瓜氨酸中的应用以及一种生产L-瓜氨酸的方法。

背景技术

L-瓜氨酸具有松弛血管，治疗性功能障碍，提高脑力等功能，近年来在食品、药物等领域越来越来受到重视，具有广泛的开发应用前景。目前L-瓜氨酸的生产方法主要有植物提取法，化学合成法、发酵法及酶转化法。其中植物提取法含量低且提取成本高，不适合大规模生产；化学有机合成法环境污染大；发酵法产物浓度较低。相比之下，酶转化法具有专一性强，产物浓度高，生产周期短，成本低等特点。

CN102703339A公开了一种高产精氨酸脱亚胺酶菌株及生产L-瓜氨酸的方法，所述菌株为粪链球菌，该菌株产L-瓜氨酸量达到98g/L。

CN102433290A公开了一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法，所述菌株是从土壤中筛选而来的粪肠球菌，发酵生产瓜氨酸，或通过发酵获得具有精氨酸脱亚氨酶酶活的静息细胞菌体并添加到浓度为5-20％的精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸，转化率可达80％以上。

CN102220390A公开了一种精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法，它采用恶臭假单胞菌转化精氨酸，能提高产品收率和降低生产成本。

CN102433289A公开了一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法，所述菌株为库特氏菌属，以此菌为发酵菌株，通过发酵制备瓜氨酸或用发酵生产的含有精氨酸酶的菌体添加到浓度为5-20％的精氨酸溶液中转化合成瓜氨酸，转化率可达80％以上。

可见，目前主要是利用粪肠球菌、恶臭假单胞菌、变形假单胞菌、库特氏菌属等发酵得到精氨酸脱亚胺酶的静息细胞生物合成瓜氨酸，尚没有利用蜡样芽孢杆菌的报导，且目前水平只能将80％以上的精氨酸底物转化成瓜氨酸，酶活能力仍然没有达到理想的工业水平。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌和利用该菌株生产L-瓜氨酸的方法，以进一步提高精氨酸的转化率，降低生产成本。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明以从土壤中获得的蜡样芽孢杆菌为出发菌株，通过N+离子束诱变进行育种，筛选得到一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌突变株93-11，该菌株已于2015年01月20日保藏于位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2015047，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)93-11。

将该菌株培养、发酵后，得到含精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌静息细胞，然后转化精氨酸生产L-瓜氨酸，具体包括以下步骤：

1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2015047的蜡样芽孢杆菌93-11经种子培养和发酵培养后，得到含精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌静息细胞；

2)将步骤1)得到的蜡样芽孢杆菌静息细胞加入到精氨酸水溶液中，调节混合溶液pH为6-7，在温度为37-50℃条件下反应，然后升温至60-100℃使蛋白凝结；

3)从混合溶液中分离纯化L-瓜氨酸。

优选地，反应前的混合溶液中蜡样芽孢杆菌静息细胞的重量含量为0.5-1％，精氨酸的重量含量为10-30％。在该条件下，精氨酸的转化率最高，转化时间最短。

优选地，所述种子培养包括一级种子培养和二级种子培养，

所述一级种子培养的培养基是：0.1-10％蛋白胨，0.1-5％酵母粉，0.1-10％氯化钠，0.1-10％甘油，余量为去离子水，pH为6-7；

所述二级种子培养的培养基是：0.1-5％甘油，0.1-5％玉米浆，0.1-5％精氨酸，余量为去离子水，pH为6-7。

采用上述种子培养基，菌株获得最适宜的营养，能快速进入对数生长期，培养时间最短。

优选地，所述发酵培养的培养基是：0.1-5％甘油，0.1-5％玉米浆，0.1-5％精氨酸，0.1-5％无机盐，余量为去离子水，pH为6-7。进一步优选地，所述无机盐为磷酸二氢钾和硫酸镁中的一种或两种组合。

采用上述的发酵培养基，(1)菌体能被诱导大量表达精氨酸脱亚胺酶，收获的静息细胞精氨酸脱亚胺酶活性最高；(2)菌体能获得最适宜的营养，生长旺盛，发酵时间最短且收获量最高。

本发明各培养基中各成分的含量均为重量含量，如0.1-5％甘油，指的是100g培养基中含有甘油0.1-5g。