[发明专利]利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程成骨细胞的方法，特别是一种利用Runx2基因表达及小分子化合物CHIR99021和/或小分子化合物forskolin，在地塞米松存在的条件下诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞的方法，属细胞生物学与组织工程领域。

背景技术

骨组织工程技术通过把成骨细胞和/或能引导骨组织再生的生物活性因子整合植入特殊的支架结构中以作为组织工程复合骨，希望替代传统的移植材料和技术。因此，骨组织工程需要大量种子细胞和专门的支架材料以支持细胞黏附和分化。传统应用的种子细胞包括分化晚期的成骨细胞、成骨细胞株、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞。但此类细胞的来源有限、获取过程复杂并伴随供体较重的伤害，因而广泛应用受到限制。

与骨髓来源细胞相比，非成骨细胞如皮肤成纤维细胞来源丰富、很容易从患者获取并进行体外长期大量扩增培养。现在利用细胞转分化技术已经可以使皮肤成纤维细胞直接转变成成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞，或先转变成多能干细胞再进一步定向分化成神经细胞或各种不同类型的功能性体细胞。引人注目的是，这些从皮肤细胞直接或间接转分化而得到的功能性神经细胞或体细胞已经不再保持原来母细胞的基因表达谱等分子与细胞特性，却获得了各种目的细胞的典型特征与功能。另外这些诱导性功能细胞不仅可以用来模拟相关的疾病，有的还成功地通过移植到疾病动物模型达到治疗目的。

为了实现高效、快速、特异性的细胞转分化，一般需要经过系统、广泛的筛选确定特异的转录因子等基因组合，在特定情况下人细胞可能比动物细胞转分化所需要的基因组合会复杂一些，有的转录因子还需要相应的信号分子协同作用才能实现转分化作用，比如我们发现了NGN2介导的人皮肤细胞转分化到神经细胞就必须有两种小分子化合物的协同作用。目前已有报道的成骨细胞转分化因子如BMP-2, BMP-7，LMP3单独或协同作用可以使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞。这几种基因表达产物为分泌性的蛋白质，其表达分泌调控复杂。由于它们能通过旁分泌作用于周围的非骨质组织引起异位骨形成，在转分化细胞中长期持续高表达可能导致对移植部位周围健康组织的副作用。

2006年，ANDRE´ S J. GARCI´A报道，通过使用对成骨细胞起决定性作用的关键转录因子，如在骨组织细胞特异性表达的转录因子Runx2，在单独用于转分化时没有效果，在有激素信号分子地塞米松的协同作用使大鼠的皮肤成纤维细胞转分化为成骨细胞。2013年邓宏魁报道，通过筛选了10000种小分子化合物后，找到4种小分子，可以实现皮肤成纤维细胞的重编程，其中CHIR99021和Forskolin在重编程过程中发挥了重要的作用。

此外，化学小分子诱导细胞重新编程转变特定类型的细胞有其独特优势：①诱导过程短，药物可高效到达靶细胞；②可控性，可以准确控制药物达到需要的浓度；③成本低，化学小分子一旦确定可以大规模生产。

发明内容

本发明目的在于克服上述现有技术存在的不足，提出一种利用必需的基因/小分子组合（Runx2/CHIR99021和Forskolin），在细胞表达Runx2 的基础上，用一定比例的小分子CHIR99021和Forskolin组合，诱导人皮肤成纤维细胞向成骨细胞分化。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗与成骨细胞分化相关的疾病的药物组合物，前期在高浓度9μm的CHIR99021和10μmForskolin的组合，保持外源导入的Runx2持续一定时间的表达，在地塞米松的协同作用下，向成骨细胞方向诱导。

本发明采用以下技术方案完成本发明目的：一种利用Runx 2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其特征是利用Runx2基因的表达及小分子化合物CHIR99021和forskolin，诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞。

先构建携带 Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮肤成纤维细胞，使正常人皮肤成纤维细胞表达 Runx2，放置普通培养液培养3～7天后，在该普通培养液再加入小分子化合物6μM～12μM的forskolin + 5～15nM的地塞米松两种物质，组成激素信号分子诱导液，在该激素信号分子诱导液中再进行7～15天的细胞培养，随后利用成骨细胞分化液进行诱导（37°C， 5%CO₂），5～7天后可诱导为成骨细胞；