[发明专利]利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法

权利要求书

1.一种利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其特征是：利用Runx2基因的表达及小分子化合物诱导人成纤维细胞转分化为成骨细胞；所述小分子化合物为forskolin，或CHIR99021和forskolin的混合物；

所述方法先构建携带 Runx2-GFP的慢病毒浸染人皮肤成纤维细胞，使正常人皮肤成纤维细胞表达 Runx2，将病毒浸染后的皮肤成纤维细胞放置在普通培养液中培养3～7天后，更换为激素信号分子诱导液再培养7～15天，随后利用成骨细胞分化液进行诱导，5～7天后可诱导为成骨细胞；所述激素信号分子诱导液是在普通培养液中加入6μM～12μM的小分子化合物forskolin + 5～15nM的地塞米松两种物质或者加入5～10μM 小分子化合物CHIR99021+ 6μM～12μM小分子化合物forskolin+ 5～15nM地塞米松三种物质组成的。

2.根据权利要求1所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其特征是：所述普通培养液配方是：10％胎牛血清 + 100U/mL青霉素 + 100μg/mL链霉素 + 高糖DMDM培养基，在37℃，5%CO₂环境下培养细胞；

所述成骨细胞分化液配方是：10％胎牛血清Hyclone + 100U/mL青霉素Sigma+ 100μg/mL链霉素Sigma+ 高糖DMDM培养基Gibco+ 10mM β-甘油磷酸 + 100nM地塞米松 + 0.2mM ascorbate-2-phosphate ；在37℃，5%CO₂ 环境下培养细胞。

3.根据权利要求1所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其特征是：所述激素信号分子诱导液中包括9μM小分子化合物CHIR99021+10μM小分子化合物forskolin+10nM地塞米松。

4.根据权利要求1所述的利用Runx2和小分子化合物诱导人成纤维细胞重编程为成骨细胞的方法，其特征是：所述方法的详细步骤如下：

（一）、质粒构建和细胞培养

1.1细胞培养

先采集普通人皮肤成纤维细胞，将人皮肤成纤维细胞培养于由10％胎牛血清Hyclone + 100U/mL 青霉素Sigma + 100μg/mL 链霉素Sigma+ 高糖DMDM组成的普通培养液Gibco中，并贴壁于包被有明胶的6 孔板中；接种细胞密度5～6×10³/cm²，培养于37℃，5％ CO₂的培养箱中；

1.2质粒构建

将来源于人类的全长Runx2 的cDNA插入到含GFP的pVSVG载体中，另外还构建仅含有GFP的pVSVG的空载；

（二）、病毒侵染细胞

慢病毒包装与感染：目的基因Runx2质粒与病毒包装质粒通过Lipofectamine 2000共转染HEK293T细胞，获得了高滴度的病毒，分别对普通的人皮肤成纤维细胞感染Runx2-GFP-PVSVG慢病毒和GFP-PVSVG空载的慢病毒，感染效率分别可达到61%和93.4%；

（三）、小分子诱导

将病毒感染后的皮肤成纤维细胞培养3～７天，使用普通培养液培养，配方是：10％胎牛血清Hyclone+ 100U/mL青霉素Sigma + 100μg/mL链霉素Sigma+ 高糖DMDM培养基Gibco；

之后更换为在普通培养液添加有小分子化合物后组成的激素信号分子诱导液再培养７～15天，激素信号分子诱导液的配方是：10％胎牛血清Hyclone+ 100U/mL青霉素Sigma+ 100μg/mL链霉素Sigma+ 高糖DMDM培养基Gibco + 5～10μM的CHIR99021 + 6μM～12μM Forskolin + 10nM地塞米松；

（四）、成骨细胞分化液

随后再更换为成骨细胞分化液进行培养，成骨细胞分化液的配方是：10％胎牛血清Hyclone+ 100U/mL青霉素Sigma + 100μg/mL链霉素Sigma+ 高糖DMDM培养基Gibco+ 10mM β甘油磷酸 + 100nM地塞米松+ 0.2mM ascorbate-2-phosphate，此后，每隔2～3天更换一次成骨细胞分化液，持续诱导5天以上;其后的细胞培养，一直使用成骨细胞分化液维持；

（五）、茜素红染色鉴定

① 将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS 清洗细胞3 次；

② 取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；

③ 去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，放在培养箱中进行；

④ 弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3 次以上，以避免出现假阳性；

⑤ 在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。