[发明专利]加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于加工食品中核桃植物源性成分鉴别的HDA引物及其应用。

背景技术

当前核桃加工食品及饮品增长迅速，受到广大消费者的欢迎。随之而来的问题是，在核桃制产品的制备过程中存在大量的不规范操作，使得所得终产品中核桃源成分的有无及其含量无法确定，导致核桃食品/饮品的质量无法保障。

与此同时，随着核酸扩增技术的发展和应用，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛的运用。特别是在现场快速检测技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使病原体的检测实现了快速、简便和高通量。在实际操作和仪器要求方面，这些等温技术都比PCR技术更为简单和廉价，从而更容易被开发成现场检测的应用产品。因此，等温扩增技术是核酸扩增技术的发展方向，具有广阔的应用前景。

依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，简称HDA)是由美国NEB公司研究人员Vincent等于2004年发明一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DAN在恒温下复制的自然过程，在恒温条件下利用生物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。主要是利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白(SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数增长。

HDA技术的优点在于：等温扩增，在一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要像PCR那样循环的温度变化；原理简单，HDA技术模拟自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂；操作简便，HDA对引物的设计与PCR相似，不需要复杂的引物设计。对于其他组分也不需要做任何特殊处理，只需要一个恒温装置即可进行反应；设备简单，HDA不需要复杂的设备，只需要一个简单的恒温器，如果选用室温可以进行反应的酶，甚至不需要恒温器就可进行反应。因此，HDA技术具有广阔的应用前景。

目前尚未见利用HDA法检测核桃植物源成分含量的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物及其应用，利用该引物进行相关检测，无论检测准度、精度或专一度都十分理想。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，所述HDA引物为：上游引物：如SEQ ID NO：1所示；下游引物：如SEQ ID NO：2所示。

利用上述HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，该方法包括如下步骤：

A、食品中DNA的提取：取待测食品样品，采用试剂盒提取其中的DNA，保存备用；

B、引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用上述两条引物；

C、HDA反应体系的建立：HDA反应体系包括：5μL 10×缓冲液，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10-0.30μg UvrD helicase，1.0-5.0μg T4gp32或1.0-6.0μg RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板食品DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH₂O补至50μL；

D、恒温扩增：将反应体系放入60-70℃恒温金属浴中恒温扩增1-3h；

E、结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。