[发明专利]加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物及其应用

权利要求书

1.加工食品中核桃植物源性成分鉴别用HDA引物，其特征在于：所述HDA引物为：

上游引物：如SEQ ID NO：1所示；

下游引物：如SEQ ID NO：2所示。

2.利用权利要求1所述的HDA引物鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、食品中DNA的提取：取待测食品样品，采用试剂盒提取其中的DNA，保存备用；

B、引物设计：引物对于检测结果的准度、精度、专一度起决定作用，直接采用权利要求1记载的引物；

C、HDA反应体系的建立：HDA反应体系包括：5μL 10×缓冲液，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10-0.30μg UvrD helicase，1.0-5.0μg T4 gp32或1.0-6.0μg RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板食品DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH₂O补至50μL；

D、恒温扩增：将反应体系放入60-70℃恒温金属浴中恒温扩增1-3h；

E、结果检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。

3.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤A中，食品中DNA提取的具体操作方法为：如果操作对象为固体样品，则经液氮研磨成粉末后取0.1g，如果操作对象是液体样品，则经冷冻干燥后取粉末0.1g；所得样品粉末加入1.5mL离心管中，加入600μl 65℃预热的BufferPCB和12μlβ-巯基乙醇，震荡混匀，置于65℃水浴25min，间或混匀，加入等体积的氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min，吸取上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中，加入等体积BufferBD，颠倒混匀3-5次，再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒的吸附柱中，室温静置2min，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μlPWSolution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl WashSolution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μlTEBuffer，静置3min，12,000rpm离心2min，得到的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续步骤。

4.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述10×缓冲液包括100mM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSO₄和1mg/mL BSA。

5.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述反应体系中还包括10U的Phi29嗜温聚合酶。

6.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述UvrD helicase的含量为0.15μg。

7.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤C中，所述T4gp32的含量为4.5μg，或者RecA蛋白的含量为3.0μg。

8.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤D中，将反应体系放入65℃恒温金属浴中恒温扩增2h。

9.根据权利要求2所述的鉴别加工食品中核桃植物源性成分的方法，其特征在于：步骤E中，吸取5μL扩增产物进行1-2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为80-120V，80-100mA，电泳时间40-50min，置市售凝胶成像系统进行结果分析，检测产物。