[发明专利]一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的联合检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病原菌的检测技术领域，涉及一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的联合检测方法，具体为嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的双标记时间分辨荧光免疫检测方法。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌,可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻(沈锦玉.嗜水气单胞菌的研究进展，浙江海洋学院学报.2008,27:78-86)。产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)是一种条件致病菌，可引起腹泻及食物中毒(于兰,等.一起产酸克雷伯氏菌引起食物中毒的调查，解放军预防医学杂志,2003,21:69)，此外会引起鳗鲡皮肤点状出血。由于在病理检验、水产养殖等领域均可检测到这两种病原菌，因此开展嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的同时检测对疾病防治具有重要意义。

传统检测病原菌的方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和荧光抗体法，这些方法具有特异性强的优点，但灵敏度不高，同时测量光谱范围宽，双标记免疫检测会互相干扰，不适于两种菌的测量。时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)荧光发射光谱窄，双标记法测量两种病原菌光谱互不重叠，此外采用长寿命的稀土螯合物标记，通过时间延迟消除背景干扰，灵敏度大为提高。但TRFIA在病原菌检测中应用不多(卢洁,等.时间分辨荧光免疫法检测日本鳗鲡产酸克雷伯氏菌,分 析化学，2012,40:1709-1714)，双标记同时测定两种病原菌更是未见报道。本方法采用TRFIA检测嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌，两种病原菌的检测灵敏度均得到了提高，由于是同时检测，简化了步骤，节省了时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的双标记时间分辨荧光免疫检测方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌的联合检测方法，具体通过以下步骤完成：

1)用碳酸盐包被液分别稀释抗嗜水气单胞菌抗体IgG1和抗产酸克雷伯氏菌抗体IgG2，加入96孔微孔板，洗涤；

2)每孔加入200μL的1％BSA，37℃封闭2h，洗涤；

3)每孔加入用分析缓冲液稀释的嗜水气单胞菌和产酸克雷伯氏菌混合菌悬液，阴性对照孔以分析缓冲液代替，37℃振荡孵育1h，洗涤；

4)将工作浓度的Sm³⁺-IgG1和Eu³⁺-IgG2等体积混合，每孔加入100μL，25℃振荡孵育90min，洗涤；

5)每孔加入200μL增强液，室温振荡15min；

6)多标记分析仪上测量时间分辨荧光TRF，测量参数设置为延迟时间0.4ms，测量时间0.4ms，嗜水气单胞菌检测固定激发波长340nm，发射波长642nm，产酸克雷伯氏菌检测固定激发波长340nm， 发射波长615nm。

7)以样品孔的TRF值(P)与对照孔的TRF值(N)之比大于2(即P/N>2)时判断为阳性。

步骤(1)具体为碳酸盐包被液稀释两种抗体，等浓度等体积混合，每孔100μL，4℃包被12h。

本发明检测方法中两种包被抗体的浓度均为1μg/mL。

本发明所述的Sm³⁺-IgG1的稀释度为1:600，Eu³⁺-IgG2的稀释度为1:1280。

本发明所述的碳酸盐包被液通过以下组分制备：Na₂CO₃1.49g，NaHCO₃2.93g，NaN₃0.2g，去离子H₂O定容至1L。

本发明所述的分析缓冲液通过以下组分制备：Tris-base 6.057g，Tween-201mL，BSA 2g，DTPA 0.0196g，NaCl 9g，NaN₃0.5g，去离子H₂O定容至800mL，浓盐酸调pH值到7.8，去离子H₂O定容至1L。

本发明所述的洗涤采用的洗涤缓冲液通过以下组分制备：Tris-ba se 6.057g，Tween-202mL，NaCl 9g，NaN₃0.5g，去离子H₂O定容至800mL，浓盐酸调pH值到7.8，去离子H₂O定容至1L。