[发明专利]一种肺癌miRNA检测试剂盒及其miRNA的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种miRNA的检测产品以及miR-21、miR-24、miR-125b和miR-126作为肺癌分子标记物的应用，属于生物技术领域。

背景技术

全球每年约130万人死于肺癌,约占全世界所有癌症死亡人数的1/3。在我国，因肺癌死亡的人数超过因肿瘤死亡人数的20％。肺癌患者出现症状时多已是中晚期，其5年生存率约在15％左右，如果患者在肺癌早期就能被诊断，其生存率将被大大提高。肺癌的发生发展是多基因参与的过程，其分子机制研究对于临床诊断具有积极意义。研究发现微小RNA(microRNA，miRNA)与肺癌等多种肿瘤的发生有关。

miRNA是一类高度保守，长度约在19－24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA,能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译,从而参与调控细胞增殖、分化及凋亡过程，一些miRNA作为原癌基因或抑癌基因已被证实。血清中内源性RNase对miRNA不起作用，血清中的miRNA可稳定存在并可作为诊断肿瘤的血清标志物。Dalmay等研究(Oncogene，2006,25(46)，6170-6175)发现miR-21在66％的肺癌患者中至少有2倍的上调。Keller等研究(BMC Cancer，2009,9:353)显示27个miRNA在肺癌血液中显著下调，分析发现miRNA诊断肺癌的准确率达95.4％，特异性为98.1％，敏感度为92.5％。Foss等研究(Thorac Oncol,2011,6(3)，482-488)表明血清miR1254和miR574-5p异常表达可早于临床诊断前数月，早期诊断NSCLC的敏感度和特异度分别为82％和77％。Shen等的研究(Lab Invest，2011,91(4)，579-587)也显示miR21、miR126、miR210和miR486-5p联合检测区分NSCLC患者和健康人群的灵敏度和特异性分别为86.22％和96.55％。

血清miRNA的检测可作为肺癌有前景的诊断和预测指标，但肺癌有关特异性miRNA表达谱的筛选、检测方法及检测程序的标准化、稳定内参基因的选择都是迫切需要解决的问题。血清中的miRNA含量远低于组织，需要一种非常灵敏且特异的检测方法；又由于miRNA引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可以直接利用，故引物及体系均需筛选及优化过程。目前对miRNA的高通量筛查一般采用芯片技术，成本高、特异性和灵敏度有限，且不能满足零散标本实时检测需求；对少数miRNA的实时检测多采用Taqman探针法，部分已形成商业化试剂盒产品，但成本和售价高昂。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测快速方便、准确率高，可以实现肺癌早期的辅助诊断的miRNA检测试剂盒，以及提供miR-21、miR-24、miR-125b和miR-126联合使用作为肺癌分子标记物的应用。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：miR-21、miR-24、miR-125b、miR-126和miR-39联合使用在制备肺癌miRNA检测试剂盒中的应用，其中miR-39作为内参。

基于上述应用本发明提出的具体技术方案是：一种肺癌miRNA检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、RCR反应体系和内参体系，所述RCR反应体系中包括分别针对miR-21、miR-24、miR-125b和miR-126的正向引物和反向通用引物；所述内参体系中包括内参miRNA-39和针对miR-39的正向引物；针对所述miR-21的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对所述miR-24的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；针对所述miR-125b的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；针对所述miR-126的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；针对所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

用于配制所述RCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。