[发明专利]一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，以GJB2基因的35delG、155delTCTG、176del16bp、235delC、299-300delAT、512insAACG突变，和GJB3基因的538C>T、547G＞A突变为检测对象，设计特异性引物和探针，所述特异性引物包括用于扩增35delG、155delTCTG、176del16bp、235delC、299-300delAT的引物1，其序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于扩增512insAACG的引物2，其序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于扩增538C>T和547G＞A的引物3，其序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述探针为特异性检测GJB2基因的35、155、176、235、299位点，和GJB3基因的538、547位点是否含有突变，其探针序列如序列表中SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14所示。

2.如权利要求1所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测235、299、176位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5；用于检测35、155、512、538、547位点的探针的荧光发光基团均为TAMRA；各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。

3.如权利要求1所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括用于监测扩增模板的有效性的1对β-Actin内参引物和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。

4.如权利要求3所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参探针为荧光标记的探针，其荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。

5.如权利要求1所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括有阴性质控、阳性质控；

所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常GJB2基因、正常GJB3基因部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:18所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含235、299、176、512突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:19所示。

6.一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其具体组成为：DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控；其中，每50μl PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl₂2.0～5.0mM、dNTPs 0.5～1.5mM、引物0.2～2.0μM、探针0.1～1.0μM、Taq酶2.0～4.0U、UNG酶0.5～1.0U，加水至50μl。

7.如权利要求6所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物为引物1、引物2、引物3和内参引物，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示。

8.如权利要求6所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针为8条检测是否含有突变的探针和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17所示。

9.如权利要求6所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常GJB2基因、正常GJB3基因部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:18所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含235、299、176、512突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:19所示。

10.权利要求1-9任一项所述的先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤如下：将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应管内，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光；根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。