[发明专利]用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术，尤其涉及基于LAMP技术的植物病菌的快速检测。

背景技术

苹果牛眼果腐病是由明孢盘菌属真菌(Neofabraea alba、N.perennans、N.malicorticis和Neofabraea undescribed species)引起的,被中国列为禁止入境的检疫性真菌病害。该病菌的寄主植物包括苹果、梨在内的多种蔷薇科果树。根据症状特点和病菌形态特征很难鉴定。对苹果牛眼果腐病菌的鉴定，目前只有采用常规PCR和测序手段同时进行判定，虽然准确率较高，但整个检测周期最少在10天左右，有时甚至长达20天，而根据《进出境动植物检疫法》规定，进境货物在实验室出具检验检疫结果之前，该批货物不得销售、使用，因此较长的检测周期，严重影响了货物的通关速度，甚至会给货主带来了不必要的经济损失。

苹果牛眼果腐病主要依靠进境水果传播蔓延，辽宁口岸是水果进境的重要口岸，业务量位居全国第二，进境水果中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定工作是阻止其传入我国的重中之重。LAMP法是近年来发展迅速的一种快速检测方法，其较与PCR最大的优势在于，检测时间大大缩短，检测结果肉眼可见，检测特异性提高两个数量及，且扩增阶段对仪器的要求低，不需要检测仪。

此方法的研发能减少真菌的鉴定时间，使用方便，可推广应用于检测一线本研究首次将LAMP方法应用于检疫性植物真菌鉴定中，旨于开发出更高效、准确的检测方法，以应用推广于实际检测工作，针对不同的使用目的，建立相应的明孢盘菌属及三个致病种的LAMP检测方法，并形成相应的试剂盒，探索建立高通量LAMP检测法的可行性，简化整个植物检疫过程，缩短检测时间，提高检测效率，创造更好的检验检疫环境。

发明内容

本发明的目的首先在于提供用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组，包括由SEQ ID No.1～4编码的四条引物：

F3：5’-ACGGATCTCTTGGTTCTGG-3’[SEQ ID No.1]

B3：5’-TTACTACGCTTAGAGCCAGA-3’[SEQ ID No.2]

FIP：5’-GCGCAATGTGCGTTCAAAGATT-GAACGCAGCGAAATGCGATA-3’[SEQ ID No.3]

BIP：5’-TGTTCGAGCGTCATTACAACCC-CGCCACTGATTTTAGGGC-3’[SEQ ID No.4]。

上述本发明的技术方案，所述用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组，尤其适用于针对明孢盘菌属致病菌的检测，所述明孢盘菌属致病菌包括：Neofabreae perennans，Neofabreae malicorticis和Neofabreae alba。

本发明另一方面的目的，在于提供一种用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP试剂盒，包括上文所述的由SEQ ID No.1～4编码的引物组。

本发明再一方面的目的在于提供一种基于LAMP的苹果牛眼果腐病致病菌检测方法，包括如下步骤：

a.提取待测样品DNA；

b.以SEQ ID No.1～4编码的4条核苷酸序为引物组，以步骤a所提取的DNA为模板进行LAMP扩增；

c.扩增产物分析及结果判断。

上述关于基于LAMP的苹果牛眼果腐病致病菌检测方法的具体实施方式中，所述的步骤b中LAMP扩增条件为：65℃恒温30～60min；80℃恒温5min或在95℃下恒温2min；终止反应。

另一具体实施方式，步骤bLAMP扩增反应体系各引物浓度为：F3，0.2u mol/L；B3，0.2u mol/L；FIP，1.6u mol/L；BIP，1.6u mol/L。

再一具体实施方式，所述的步骤b中LAMP扩增反应体系的待测样品DNA浓度为1.6ng/μL。优选在所述的步骤a制备的DNA样品时，控制所述DNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.7～2.0。其中OD₂₆₀和OD₂₈₀分别是DNA样品在260nm和280nm的吸收值。

具体的实施方式中，所述的基于LAMP的苹果牛眼果腐病致病菌检测方法包括如下步骤：