[发明专利]适于多重PCR反应的南瓜SSR标记引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一组适于多重PCR反应的南瓜SSR标记引物，本发明还涉及该引物在南瓜品种鉴定上的应用及一种南瓜品种鉴定方法。

背景技术

简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)是指基因组上存在的1-6bp长度的碱基串联重复序列，因为重复次数的不同而在不同个体间表现出多态性。简单重复序列已经被广泛地用于开发SSR标记。SSR标记因具有多态性高、重复性好、呈共显性遗传和在基因上覆盖范围等优点，而被广泛地用于遗传图谱的构建、基因定位和品种鉴定等领域。

SSR标记是一种序列特异性标记，开发SSR标记必须事先知道SSR位点及其侧翼的DNA序列，然后根据侧翼序列设计扩增产物包含SSR位点的引物对，之后再检查该扩增产物在不同基因型个体之间的变异，即多态性。因此，SSR标记具有物种特异性，即不同物种之间的SSR标记多数情况下都不能通用，对于不同物种而言，SSR标记需要单独开发。

南瓜是一种主要的葫芦科蔬菜作物，分为食用南瓜、籽用南瓜、砧用南瓜和饲料用南瓜等，用途广泛，经济价值高。目前公开报道的南瓜的SSR标记数量非常有限，尚不能满足南瓜分子标记辅助选择育种的需要。

SSR标记分析步骤通常包括以下几步：提取样品DNA；使用SSR标记引物对样品DNA进行PCR扩增；扩增产物用变性或者非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；电泳完成后用银染法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色；照相记录结果。由于聚丙烯酰胺制胶、电泳和染色耗时较长，而且每次只能检测一对引物，这些不足显著地降低了SSR分析的效率。

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。利用多重PCR方法在一次PCR反应中扩增多个SSR位点，可以显著地提高SSR标记分析的效率，降低实验成本。但由于不同引物对在同一个PCR反应中会存在相互干扰导致PCR扩增失败，以及扩增产物增多导致结果读取困难等不利因素的存在，导致建立SSR标记的多重PCR技术十分困难。因此，开发能用于多重PCR反应的SSR标记及其相应的PCR扩增技术体系将显著提高SSR标记的分析效率。

发明内容

本发明利用南瓜转录组测序结果，开发了3个多态性高、扩增产物长度差异大、在同一个PCR反应中不相互干扰的南瓜SSR标记，并通过优化PCR扩增体系和程序，建立了包含以上3个SSR标记的多重PCR反应体系，将之用于南瓜品种鉴定，能显著提高SSR标记的分析效率，降低分析成本。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：对来自两份南瓜种质材料的转录组测序结果进行分析，鉴定出SSR位点；利用Primer3 Plus软件设计SSR位点侧翼引物；利用61个南瓜商业品种验证SSR位点的多态性；筛选多态性高、PCR扩增质量高、产物大小差异大的3组SSR标记引物进行多重PCR反应；优化PCR反应体系和扩增程序，获得稳定的南瓜SSR标记的多重PCR技术体系并用于检测南瓜品种间的遗传差异。

所述的3组SSR标记引物为：

第一组引物，其正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；

第二组引物，其正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；

第三组引物，其正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示。

所述的PCR扩增体系为：总体积25μL，含有1×buffer，2.4μM MgCL₂，240μM dNTPs，0.6U Taq酶，三组引物的正、反向引物各0.16μM，30ng DNA。

所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min 30s，34个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

本发明的特点在于：利用自有的南瓜转录组测序结果开发了新的南瓜SSR标记，通过选择和技术体系优化，利用这些标记建立起了一个包含3个SSR标记的高质量的多重PCR技术体系。

本发明的优点是：