[发明专利]对血液中抑制剂具有增加的抗性的热稳定性A型DNA聚合酶突变体

说明书

本发明提供了具有增强的对DNA聚合酶活性抑制剂的抗性的DNA聚合酶突变体。所述突变体聚合酶特别适合于含有野生型聚合酶抑制剂的样品中的靶标的PCR扩增。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年2月14日提交的美国临时申请No.61/940,172的优先权。将该申请的内容通过提述完整并入本文。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及改进的用于进行聚合酶链式反应(PCR)的聚合酶并涉及进行PCR的方法。

发明背景

PCR是应用最广泛的核酸检测方法之一。该方法在感染性疾病和遗传性紊乱的研究和分子诊断中具有广泛应用。在许多应用中，对基于血液的PCR诊断的需求尤多。

一方面，血液是人体循环系统的一个重要部分。它包括许多类型的宿主细胞，包括正常细胞、病变细胞(例如，循环肿瘤细胞)，并且，如果宿主是怀孕的母亲，还包括胎儿细胞，以及来自这种细胞的遗传物质，比如microRNA。事实上，基于血液的PCR由于其最小介入性在一些情况下，诸如使用母体血液样品进行胎儿诊断时具有优势，其没有与常规羊水检查相关的流产风险。在某些情况下，血液也含有病原体，如病毒和细菌。对应地，基于血液的诊断可以提供人体内任何给定的时间的情况的即时图景。在另一方面，血液是用于在许多创伤或病理情况下提高生活质量和挽救生命的各种药品和血液制品(例如全血、血浆、抗体、和干细胞)的来源。血液、血浆、和其他血源性成分的治疗用途要求这些成分的捐献尽可能地不受病变细胞(例如肿瘤细胞)或病原体(例如HIV、HBV、和HCV)的污染。参阅，例如，美国申请20130316925、20130157253、20120329061、20120070827、20120034614、20070281307、和20070105121。

然而，基于血液的PCR诊断受到了许多后勤和技术挑战的限制。来自生物样品的核酸诊断(nucleic acid diagnostics)伴随着多方面的挑战。复杂生物样 品，诸如血液和细胞裂解液，具有多种能抑制PCR反应中使用的DNA聚合酶的组分。这些组分包括血液中的血红蛋白、免疫球蛋白G、乳铁蛋白和蛋白酶。尽管已经开发了在尝试PCR反应之前纯化样品的各种规程，但这些步骤通常耗时、费力，并且可能达不到后续PCR所要求的纯化。此外，含有核酸的细胞(例如白细胞和胎儿细胞)仅仅占了血样的一小部分，宝贵的核酸可能在PCR反应步骤之前从样品中丢失。

当操作血液时，一个关键点在于血样应该收集在抗凝剂中以防凝固，因为从凝固的血中分离核酸的效率低下，且大多数细胞将损失在凝块中。然而，在血样收集中例行使用的抗凝剂，如EDTA和肝素等，会干扰或抑制PCR。例如，肝素是高度带负电荷的，会与DNA共提取，从而抑制PCR反应。参阅，例如，García等J.Clin.Microbiol.2002年4月第40卷第4期1567-1568，和Yokota等Journal of Clinical Laboratory Analysis，第13卷，第3版，第133–140页，1999。

因此，需要对上述抑制剂更具抗性且适用于使用血样的PCR反应的试剂，如DNA聚合酶。

发明内容

本发明涉及热稳定性A型DNA聚合酶突变体，其对全血中的抑制剂具有增加的抗性，所述抑制剂包括天然血液组分(红细胞中的血红蛋白、白细胞中的乳铁蛋白)或血浆(免疫球蛋白G)、或添加的抗凝剂(如EDTA和肝素)。