[发明专利]获得高产稳定表达细胞克隆的方法及由此获得的抗体分子

说明书

本发明涉及在无蛋白培养基中获得重组骨髓瘤细胞克隆的方法。这个过程包含重组骨髓瘤细胞系，在这个过程中，从无血清培养基到无蛋白培养基几乎是不可能的或者需要很长的时间，并且由于非生长细胞群的存在而伴随着抗体产量的降低。这个过程包含在无蛋白培养基中由低浓度到高浓度逐渐适应的过程。在无蛋白培养基中以高细胞密度培养的表型适应伴随着重组抗体分子分泌率和高产稳定表达细胞克隆百分比的提高。在本发明中公开的细胞克隆能够生产人源化的抗NeuGcGM3 14F7h重组抗体。更进一步的，这个人源化的抗‑NeuGcGM3 重组抗体14F7hare的属性特征也在本发明中被公开。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种有效的获得高产稳定表达细胞克隆的方法，该方法用于在灌流发酵工艺中生产治疗性抗体。

背景技术

治疗性抗体构成了生物技术药物市场的主要类别（Walsh G, 2014, NatureBiotechnology 2014, 32: 992 – 1000）。一些治疗性抗体已经获得注册批准用于治疗癌症、自身免疫性疾病和其他慢性病，几十种重组抗体也正处于不同的临床阶段（BiologicMedicines in Development, Phrma Report 2013, www.phrma.org）。通常，病人接受治疗性抗体，每一个剂量下要几百毫克，因此，目前全世界范围内对抗体产能的需求是巨大的。

几种方法已经被用于提高工业细胞系的产能，例如，基因扩增系统，细胞培养基的优化和选择高产稳定表达的细胞克隆。基因修饰和重组骨髓瘤细胞系的表观遗传适应来生产治疗性抗体是目前非常有竞争性的研究领域（Barnes et al., 2000, Cytotechnology32:109-123; Barnes et al., 2007, Biotechnol Bioeng 96:337-349）。

基于灌流发酵的生产工艺允许在发酵收获液中有高密度的细胞培养和潜在的高抗体浓度，然而，长期的高密度细胞培养需要高产稳定表达的细胞克隆来真正优化抗体的生产。无蛋白培养基已经被开发出来用于生物药的生产，例如，PFHMII细胞培养基（购自美国Hyclone公司）。

重组抗体生产的NS0细胞系已经被成功适应于无蛋白培养基（WO 2004/038010A1），然而，适应于无血清培养基和下一步的无血清培养基中的长时间发酵工艺通常伴随着细胞系产能的损失（Barnes et al., 2003, Biotechnol Bioeng 81: 631-639; Barneset al., 2004, Biotechnol Bioeng 85: 115-121）。适应于无蛋白培养基的高产稳定表达细胞克隆能从不稳定的重组骨髓瘤细胞系中重新获得（CN104152415A）。

但是实践中，一些重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白培养基的适应过程是不可能的或者需要很长的时间，同时由于非生产细胞群的出现而导致抗体产能的损失。具有工业潜能的细胞系的选择工艺必须不断改进。