[发明专利]获得高产稳定表达细胞克隆的方法及由此获得的抗体分子

权利要求书

1.一种在无蛋白培养基中从重组骨髓瘤细胞系获得高产稳定表达细胞克隆的方法，所述方法用于工业上生产人源化重组抗NeuGcGM3的抗体14F7h，其特征在于，所述的方法包含三个阶段：

I.适应无蛋白培养基，低密度静止细胞培养，逐步减少富含脂质的补充物到化学培养基中；

II.适应无蛋白培养基：以高密度细胞培养，在实验室规模5L生物反应器中采用灌流发酵系统；

III.发酵结束时从细胞中筛选高产稳定表达的细胞克隆

所述高产稳定表达细胞克隆，在细胞培养90天，进行稳定性评价，比生长速率μ高于0.025h^-1，比生产速率QP高于0.18pg/cell*h；

重组骨髓瘤细胞系是包含编码人源化重组抗体14F7h序列的NS0细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段I包含以下步骤：

I.适应生长在补充3.5g/L Cell Boost 5的PFHMII细胞培养基,传代培养，直到活细胞的最大浓度Xv达到一个恒定值；

II.适应生长在补充1g/L Cell Boost 5的PFHMII细胞培养基，传代培养，直到活细胞的最大浓度Xv达到一个恒定值；

III.适应生长在PFHMII细胞培养基中,细胞允许在无任何补充剂的无蛋白培养基中生长60天。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段II包含以下步骤：

I.适应生长在无蛋白质PFHMII细胞培养基中，以高细胞密度，在5L生物反应器中使用灌流发酵系统生长超过21天，所述高细胞密度为(5-10)×10⁶cell/ml；

II.发酵结束后，细胞被冻存在液氮中，即最终生产细胞库EPCB。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段III包含以下步骤：

I.从最终生产细胞库中解冻的细胞采用有限稀释法进行细胞克隆；

II.分泌抗体的克隆采用高灵敏度和特异性ELISA方法检测，使用抗14F7h独特型抗体4G9作为捕获抗原；

III.在选择的克隆中使用细胞内免疫印染FACS进行抗体生产细胞亚群的定量检测；

IV.选择比生长速率μ和比生产速率qp高的克隆进行动力学研究。