[发明专利]一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程及生物资源转化利用领域，涉及一种纤维素分解真菌的筛选方法。具体地讲，本发明涉及一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法。

背景技术

纤维素是自然界贮量最丰富的可再生资源，据估计，通过光合作用，每年可合成纤维素10¹¹～10¹²吨。将秸秆纤维素降解为可发酵性糖，进一步转化为乙醇、单细胞蛋白及气体燃料等，对解决全球面临的能源危机、食品短缺及环境污染等问题具有重大意义，成为世界关注的热点。

纤维素是由D葡萄糖分子以β-1，4-糖苷键组成的高聚物，其结构稳定，不易降解，目前，纤维素有效转化的难点在于如何高效地将它降解为可发酵性糖，与酸水解法(产糖率低于60％)相比，酶催化水解的产糖率大于90％，其核心之一是优良的纤维素酶工业生产菌株，酶催化水解具有反应条件温和、无副产物和污染少等优势。

纤维素分解真菌广泛存在于土壤、纤维素植物表面、亦可栖息于动物的消化道，特别是反刍动物的瘤胃中。一般自然界在好氧条件下纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用；而在厌氧条件下纤维素的分解，主要是一些厌氧性的细菌起作用。通过从自然界分离筛选出产纤维素分解酶的菌株，并通过生物技术提高其产酶效率，是解决纤维素有效转化利用的重要环节。

大量研究表明，纤维素酶是一种多组分的复合酶系，主要包括3种组分：内切型β-1，4-葡聚糖酶，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切型β-1，4-葡聚糖酶，它作用于纤维素线状分子末端，水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，此酶与滤纸酶(FPase)活性有很好的相关性；纤维二糖酶，这类酶能将纤维二糖和水溶性纤维寡糖水解成葡萄糖分子。

目前常用的产纤维素酶的菌株分离筛选方法大致为：台盼兰法(typan blue)、CMC-天青法(CMC-azure)、凉乙醇沉淀法(precipitation with chilled ethanol)、十六烷基三甲基溴化氨法(hexadecy trimethylammoneum bromide)、Unitex染色法(Unitex dyes)、刚果红法(congo red)等，其中，刚果红法是目前比较公认的一种分离方法。刚果红法的原理是：刚果红能与培养基中的纤维素(多糖物质)形成红色复合物，但不与单糖结合，微生物在此培养基上生长，产生的胞外纤维素酶将纤维素降解后，红色复合物解体，通过NaCl溶液冲洗后，在菌落周围形成透明圈，能形成透明圈的菌落为初筛目标菌。将初筛得到的单菌再行纤维素滤纸崩解实验或纤维素酶活性测定后才能确定目标菌。

现有技术存在的缺陷在于：在刚果红初筛平板培养基上真菌的菌落易长满平皿而影响水解圈的观察；平板培养基上细菌快速生长影响目标菌的分离；刚果红能与培养基中的纤维素(多糖物质)形成红色复合物，也能和淀粉形成红色复合物，因此产淀粉酶的菌株也能干扰筛选结果；刚果红初筛得到的菌株需进行滤纸崩解的鉴别实验，该实验是以目测纤维素滤纸的崩解效果，由于纤维素滤纸在液体培养基中会软化、溶胀，振荡后易破碎，因而影响纤维素酶分解效果的判断。

发明内容

本发明的目的是建立一种快速、准确地从各种复杂样品(包括土壤、垃圾、污泥等)中分离筛选纤维素分解真菌的方法。

以解决现有纤维素分解真菌的分离筛选技术中存在的问题，如在刚果红初筛平板培养基上真菌的菌落易长满平皿而影响水解圈的观察；平板培养基上细菌快速生长影响目标真菌的分离；刚果红能与培养基中的纤维素(多糖物质)形成红色复合物，也能和淀粉形成红色复合物，因此产淀粉酶的菌株也能干扰筛选结果；刚果红初筛得到的菌株需进行滤纸崩解的鉴别实验，该实验是以目测纤维素滤纸的崩解，由于纤维素滤纸在液体培养基中会软化、溶胀，振荡后易破碎，因而影响纤维素酶分解效果的判断。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种快速分离筛选纤维素分解真菌的方法，包括如下步骤：

A、选择性富集培养与初筛：取样品10g加入至200ml富集筛选培养基中，28℃，150r/min摇瓶培养6～10天，分别吸取样品培养液2ml离心，10000rpm，10min，取500μl用分光光度计检测，测590nm的OD值，选OD值大于0.3的试样为候选含有产纤维素酶菌种的试样，取该试样的菌液作梯度稀释，在PDA平板上分离出单菌落；