[发明专利]一种用于检测LEPR基因245bpdeletion可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物，以及包含该引物的试剂盒及检测方法。

背景技术

瘦素(Leptin)主要是由非鸟类脊椎动物白色脂肪组织分泌的小肽类激素，与瘦素受体（LEPR）结合发挥其生物学功能。然而，LEPR的功能研究由于禽内源性Leptin的缺乏而受到限制。最近，鸟类Leptin基因的成功克隆将鸟类Leptin及LEPR的研究又推向了新的高潮。鸟类LEPR基因组织广泛性表达特征已得到证明，但其多种可变剪接体的鉴别和分离进展相对缓慢，这将在一定程度上阻碍了LEPR基因生理功能的研究。因此利用分子生物手段鉴别某一剪接体组织表达模式，进而对其生物学功能的阐明具有推动作用，意义重大。

可变剪接体是影响蛋白质发挥功能的重要原因之一。LEPR是一种跨膜受体，属于I类细胞因子受体家族，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成。目前的研究将LEPR的可变剪接体分为3类，即：长型、短型和可溶型。在小鼠中已经发现6种LEPR剪接异构体（LEPR-a, b, c, d, e, f），其中包括长型（LEPR-b）、短型（LEPR-a,c,d,f）和可溶型（LEPR-e），其功能研究近年来也取得了一定的进展。然而，在鸟类尤其是禽类中仅发现两种LEPR剪接异构体（长型和短型），而且检测繁琐、耗时长、准确率低，因此深入探究剪接体的生物功能是亟需解决的技术问题。

发明内容

    针对上述情况，为客服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，可有效解决现有的检测方法程序繁琐、耗时长、准确率低的问题。

本发明解决的技术方案：在对鸟类（如鹌鹑）的LEPR基因克隆和功能研究的过程中发现第9外显子和第11外显子之间有一245bp的缺失片段，这种缺失符合GT-AG剪接模式，预测蛋白序列属于可溶型受体，据此本发明解决的技术方案是

    一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物，包括引物对P和引物对ACTB，

所述的引物对P为：

上游引物，P-F：5’- TCCCTACCAAGATGCTGAC -3’；

下游引物，P-R：5’- TTGCTCGCGATCGTTCACA -3’；

所述的引物对ACTB为：

上游引物，ACTB-F：5’- GAGAGAAGATGACACAGAC -3’；

    下游引物，ACTB-R：5’- GTCCATCACAATACCAGTGG -3’。

一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的试剂盒，所述试剂盒包括引物对P、引物对ACTB、2×SYBR^?Premix Ex Taq^TM和去RNA酶的超纯水。

    一种检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的的方法，包括以下步骤：

   （1）以待测cDNA为模板，以引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR（简称qPCR，下同）扩增ACTB内参基因，以引物对P为引物实时荧光定量PCR扩增LEPR基因245bp deletion可变剪接体，所述的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2×SYBR^?Premix Ex Taq^TM 9~11μL，去RNA酶的超纯水7~8μL，引物P-F或ACTB-F0.5~1μL，引物P-R或ACTB-R0.5~1μL，cDNA模板0.5~1.5μL构成，其反应方法是92~96℃预变性4~6min，92~96℃变性8~12s，55~65℃退火25~35 s，70~74℃延伸25~35s，35~45个循环；

（2）对步骤（1）的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用 2^-△CT相对定量的方法计算，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。

     本发明还提供了所述的引物对P和引物对ACTB在检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体中的应用。