[发明专利]一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域中DNA多态位点的检测方法，具体说是一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法。

背景技术

线粒体是动物细胞的动力工厂，机体内90％以上的能量都是由线粒体内膜呼吸链复合体氧化磷酸化合成的ATP提供。线粒体基因组(mitochondrial genome，mtDNA，线粒体DNA)是动物体内唯一长期、稳定存在的核外基因组。动物线粒体基因组因其在世代间没有基因重组、呈现严格母系遗传、拷贝数高等特点，被广泛用于动物起源进化、物种鉴定、疾病诊断、衰老、抗病力以及动物经济性状的研究与应用。

线粒体基因组多态分析是开展线粒体功能相关研究与应用的前提。目前，线粒体基因组多态分析没有系统的方法报道，特别是缺少针对不同群体(品种)间的线粒体基因组多态分析方法。针对线粒体基因组多态分析方法，目前使用较为广泛的是利用线粒体基因组覆盖引物的PCR测序技术，即针对来自不同母系的个体，逐一进行线粒体基因组分段引物的PCR扩增及PCR产物的测序。该方法存在两个缺陷：一是该方法费时、费力，需要大量的PCR扩增和PCR产物测序的重复操作；二是更为关键的缺陷，该方法没有考虑核线粒体假基因可能存在的干扰，因此在检测DNA多态的结果上存在假阳性的风险，即可能导致对线粒体基因组多态的分析出现错判。

核线粒体假基因(Nuclear mitochondrial pseudogen，NUMT)是线粒体基因组(线粒体DNA)序列在物种进化过程中插入到核基因中的DNA片段。自1967年第一次通过核DNA和mtDNA杂交在小鼠肝 脏中发现NUMT以来，几乎所有的高等动物核基因组都发现了NUMT的存在。通常情况下，利用常规PCR和通用引物会将mtDNA和NUMT的靶序列共扩增出来，导致mtDNA多态检测出现假阳性的结果。例如，mtDNA条形码是为了快速鉴定物种而设计的一小段标准基因序列作为物种特异标记，比如说选择物种保守基因COI作为一个DNA条形码，但是在此序列存在NUMT的对应序列，如果引物设计不当，很容易导致mtDNA与NUMT的共扩增而不能有效鉴定物种来源(Moulton et al.，2010)。另一个典型的例子是mtDNA突变与Alzheimer’s疾病之间的关系，同样也是因为有NUMT的存在而影响了对该mtDNA突变的判断(Wallace et al.，1997)。这两个例子都说明了NUMT已经成为mtDNA多态研究的影响因素。所以，有效排查NUMT是开展mtDNA研究必要的环节。

因此，开展线粒体功能相关研究与应用需要建立一整套系统的群体(品种)间线粒体基因组多态分析的技术方法，同时，群体(品种)内线粒体基因组多态检测技术也需要完善(排查NUMT)，现行方法中大量的PCR扩增和PCR产物测序的重复操作也需要从分析策略上加以改进。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，运用全基因组测序策略，采用DNA混池测序技术，通过线粒体基因组覆盖引物设计、NUMT排查、基因组混池构建、PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析，建立了一整套线粒体基因组多态分析的方法，既排除了NUMT对线粒体基因多态分析的潜在干扰，获得了真实的线粒体基因组多态信息，又能高效、便捷地获得品种内、品种间的多态信息。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种快速检测不同品种猪线粒体基因组多态位点的方法，其特征 在于，包括如下步骤：

步骤1，线粒体基因组覆盖引物设计；

步骤2，NUMT排查，得到覆盖全线粒体基因组的特异PCR引物；

步骤3，基因组混池构建；

步骤4，PCR扩增、DNA测序、序列拼接和SNP分析。

在上述技术方案的基础上，步骤1中，参照已有线粒体基因组序列，设计线粒体基因组PCR引物，所述线粒体基因组PCR引物扩增覆盖线粒体基因组片段，且保证每对引物在扩增单一DNA模板(样品)时只特异扩增mtDNA片段，无测序套峰出现。

在上述技术方案的基础上，步骤2中，用步骤1设计的线粒体基因组PCR引物分别对单一DNA模板(样品)进行扩增和PCR产物测序，其中：

扩增片段应为单一特异条带，否则需要优化扩增条件或重新设计引物直至出现单一特异条带；