[发明专利]一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法

说明书

技术领域

一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法，属于毛细管电泳检测及儿茶酚氧甲基转移酶检测技术领域。

背景技术

儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）广泛存在于神经系统及机体组织内，是儿茶酚胺类神经递质的主要代谢酶之一。COMT是脑内前额叶皮层多巴胺水平的主要调节器，已有文献报道抑郁与脑内多巴胺功能失调有关。而评价脑内多巴胺功能状况的方法之一是测定COMT的活性浓度。

随着社会的高速发展，工作、生活及精神压力的增加，抑郁症的发病率逐年上升。据世界卫生组织统计每45000万精神疾病的患者中有15000万是抑郁症患者。抑郁症给患者、家人带来极大的痛苦。因此，研究抑郁症的发病机制及药物的作用靶点对抑郁症的防治极为重要。

国内外神经科学研究者相继进行了一些关于抑郁症患者红细胞COMT活性浓度的检测研究。文献报道的COMT的活性测定方法有放射性检测法，但其对环境存在污染；而荧光法测定必须进行衍生化，操作复杂；电化学法检测法需特殊的检测器。我们以3,4-二羟基苯甲酸为底物，建立了毛细管电泳快速检测COMT活性的分析方法，该方法简便快速，未见文献报道。

文献报道慢性应激诱导氧化性损伤可导致抑郁、焦虑等精神性紊乱疾病。使用慢性应激法使动物每天处于无法预期的压力环境中使其出现抑郁症状可以成功建立抑郁症模型。PQQ（化学名称为4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9一三羧酸），它具有很强的自由基清除作用，并具有提高认知功能等作用，它在神经精神疾病方面具有较重要的研究前景。PQQ对于氧化性损伤诱发的抑郁症是否具有修复作用，能否作为新的治疗靶点对抑郁症的发病机制和治疗是值得深入研究的。

本发明用所建立的毛细管电泳方法研究PQQ对慢性应激诱导氧化性损伤所致抑郁模型鼠脑内COMT活性的变化，未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法。

本发明的技术方案：一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法，步骤为：

（1）毛细管选择及预处理：

选用未涂层石英毛细管柱（45cm×50μm，河北永年县锐沣色谱器件有限公司），新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1M NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗15min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲洗2min；

运行缓冲液为：200mmol/L PBS体积百分60%+75 mmol/L硼酸体积百分40%的缓冲体系，pH=10，含缓冲体系体积百分0.05%三氟乙酸；

（2）毛细管电泳分析条件：

检测波长是350nm，进样方式为压力进样（0.5psi，10.0 s），分离电压为25kv, 毛细管柱温25℃，运行缓冲溶液为：60% 200mM PBS+40% 75mM 硼酸（pH10.0）含0.05%的三氟乙酸。缓冲液及样品溶液均用0.22μm微孔针头过滤器过滤。

测定原理

在Mg²⁺(MgCl₂)和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)的存在下，COMT催化底物3,4-二羟基苯甲酸，生成产物4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，以3,4-二羟基苯甲酸标准品外标法测定组织液中剩余3,4-二羟基苯甲酸的浓度，COMT酶活以测定单位时间内每毫克蛋白转化生成的产物量表示。

（3）标准曲线的建立：

标准溶液的配制：精密称取对照品3,4-二羟基苯甲酸0.005g，溶于5mL 50mM PBS缓冲液配成1mg/mL的储备液，用该缓冲液稀释成25、50、100、150、200μg/mL的3,4-二羟基苯甲酸标准溶液进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，结果在25-200μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y=166111x+11747，相关系数r²=0.9951，在25～200μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，最低检出浓度为0.02~0.5μM，S/N≥3；

（4）脑组织COMT酶活性测定

（4.1）样品的制备：

脑组织处理：